La tinción de ARN FISH es útil para la visualización, identificación y cuantificación de microbios que colonizan o infectan naturalmente C.elegans, incluidas las bacterias del microbioma y los patógenos intracelulares. Esta técnica es simple, rápida y robusta, lo que permite teñir y visualizar eficazmente los microbios en el contexto de un animal intacto completo. Podemos usar RNA FISH para detectar y visualizar bacterias del microbioma intestinal en C. elegans silvestres.
Esto puede ayudarnos a comprender interacciones comparables en sistemas de mamíferos. Después de transferir nematodos con el microbio deseado de interés, de placas NGM a tubos de microcentrífuga, lave los nematodos agregando un mililitro de PBST 1X a los tubos de microfuga. Haga girar las muestras en una microcentrífuga o nanofuga a la velocidad adecuada.
Con una pipeta, retire todos menos 100 microlitros del sobrenadante. Repita el lavado con PBST dos o tres veces. Para fijar los nematodos con paraformaldehído, comience agregando 33 microlitros de paraformaldehído al 16% al tubo de microfuga que contiene 100 microlitros de sobrenadante sobre el pellet de nematodo para una concentración final de 4% de paraformaldehído.
Incubar las muestras que contienen los nematodos colonizados o infectados con el microbio de interés durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de paraformaldehído y agregue 0,5 mililitros de PBST a las muestras. Haga girar las muestras en una microcentrífuga a la velocidad apropiada como se menciona en el manuscrito de texto.
Con una pipeta, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet. Agregue 0.5 mililitros de PBST a las muestras en los tubos de microfuga. Repita el lavado con PBST dos o tres veces.
Después del último lavado, gire las muestras y retire el sobrenadante, dejando el pellet intacto. A continuación, prepare un mililitro de tampón de hibridación por muestra. Agregue 800 microlitros de tampón de hibridación a los tubos de microfuga que contienen el pellet de nematodo.
Granular las muestras en la microcentrífuga. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita. Preparar 100 microlitros por muestra de tampón de hibridación con la sonda FISH deseada hasta una concentración final de 5 a 10 nanogramos por sonda de microlitros y vórtice para mezclar.
Agregue 100 microlitros de tampón de hibridación que contenga sonda FISH a cada muestra. Mezclar moviendo suavemente o invirtiendo los tubos. Incubar las muestras durante la noche en un baño seco a 46 a 54 grados centígrados o un mezclador térmico a 46 a 54 grados centígrados a 1.200 rotaciones por minuto.
Prepare tres mililitros de tampón de lavado por muestra. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Retire el tampón de hibridación con una pipeta teniendo cuidado de dejar el pellet del nematodo intacto.
Agregue un mililitro de tampón de lavado preparado a cada muestra. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Retire el tampón de lavado con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
Agregue un mililitro de tampón de lavado preparado a cada muestra. Incubar las muestras durante una hora a 48 a 56 grados centígrados en un baño seco o mezclador térmico a 48 a 56 grados centígrados a 1.200 rotaciones por minuto. Si se incuba en un baño seco, invierta suavemente los tubos cada 15 a 20 minutos.
Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Con una pipeta, retire el tampón de lavado, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto. Agregue de 100 a 500 microlitros de PBST a cada una de las muestras.
En este punto, las muestras se pueden almacenar en PBST a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana hasta que el protocolo esté listo para continuar. Pellet las muestras a la velocidad adecuada. Retire la mayor cantidad posible de PBST sin alterar el pellet del nematodo.
Agregue 20 microlitros de medio de montaje anti-decoloración con DAPI a las muestras. Cargue una pipeta de 20 microlitros con una punta de pipeta de 200 microlitros y use tijeras para cortar la punta de la pipeta y permitir que se pipeteen nematodos más grandes. Con la punta de la pipeta cortada, transfiera de 5 a 10 microlitros del pellet a un portaobjetos de microscopio.
Cubra con un cubreobjetos de 22 por 22. Para guardar los portaobjetos, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y manténgalos en una caja oscura a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para su uso posterior. Bajo el microscopio de contraste de interferencia diferencial, se encontró que una cepa silvestre de Caenorhabditis tropicalis estaba colonizada con una bacteria que parece adherirse direccionalmente al epitelio intestinal.
La señal fluorescente de la sonda verde universal 16S rRNA y la sonda roja de especies Alphaproteobacteria se superponen completamente, lo que sugiere que la mayoría de las bacterias que colonizan los intestinos son la bacteria Alphaproteobacteria adherida. El genoma de ARN bipartito del virus de Orsay consiste en segmentos de ARN1 y ARN2 y se han desarrollado sondas FISH dirigidas a ambos segmentos. La proteína ZIP1 marcada con proteína fluorescente verde se observa localizada en los núcleos intestinales de las células que muestran tinción positiva de FISH del virus de Orsay en el citoplasma.
Se muestran múltiples animales teñidos con FISH específicos de Orsay o específicos de N.parisii para indicar la intensidad de esta señal para facilitar la cuantificación. Coinfección de C.elegans con dos parásitos microsporidios utilizando sondas específicas de la especie que compiten por unirse al 18S, el uso de DAPI para teñir núcleos permite una mejor localización de la infección en el contexto de todo el animal, especialmente para el intestino que tiene núcleos grandes y fácilmente identificables. Las infecciones con N. parisii resultan en el desarrollo de meronts en esporas.
La tinción FISH resultante demuestra estructuras pequeñas y grandes en forma de varilla que probablemente se corresponden con las esporas de N.parisii, que se tiñen con sondas específicas de N.parisii en rojo. Al seleccionar el agente fijador, recuerde que la fijación de PFA permite una mejor preservación de la morfología y la GFP transgénica, pero la fijación de acetona es necesaria para la visualización de los esporoplasmas. RNA FISH se puede utilizar para identificar y visualizar bacterias que colonizan los intestinos de C. elegans.
Luego, los investigadores pueden realizar más exámenes genéticos para identificar los factores involucrados en estas interacciones huésped-microbio.
