培养的人间充质干细胞细胞外囊泡的分离、表征和治疗应用

该程序解决了对简单可靠的间充质干细胞衍生的细胞外囊泡收集的需求，以及在研究翻译中的应用。通过差速离心收集细胞外囊泡简单、易于扩展且可重现，这将对该领域有用。细胞外囊泡不明显}从模糊不清}间充质干细胞是模糊不清}在现代疾病治疗中的应用。

我不会害怕错误。此操作简单易学。这个简单的程序中有许多细节可以通过视频更好地呈现。

首先，将间充质干细胞培养至90%以上汇合。用 8 mL 补充的 α-MEM 替换每个培养皿中的培养基。培养48小时后，细胞必须均匀生长，以将培养基完全收集到50 mL离心管中。

然后，将培养基在4摄氏度下以800×g离心10分钟。将上清液转移到 1.5 mL 锥形管中以去除细胞碎片和细胞碎片。将上清液在16， 000×g下在4摄氏度下离心30分钟。

使用移液器将悬浮液转移到超速离心管中。然后，在4摄氏度下以150， 000×g离心两小时。将微泡沉淀重悬于每皿 50 uL PBS 中。

弃去上清液并收集残留物，即外泌体。将七个细胞培养皿中的外泌体重悬于50uL的PBS中。在 15 mL 管中，在 1， 499 uL PBS 中稀释 1 uL 细胞外囊泡并混合。

然后，启动跟踪分析器的兼容软件。用蒸馏水填充样品池，然后让仪器开始检查样品池。用准备好的标准溶液校准仪器。

确保软件检测界面显示的颗粒数在 50 到 400 之间，最好在 200 左右，然后单击确定。接下来，用 5 mL 蒸馏水冲洗样品池。样品分析前，用 1 mL 蒸馏水冲洗通道。

确保软件检测界面显示的颗粒数小于10。在 1.5 mL 锥形管中，用 250 uL PBS 重悬细胞外囊泡。在另一个 1.5 mL 锥形管中，制备 PKH26 染料的工作溶液。

将重悬的细胞外囊泡与工作溶液混合。让它在室温下静置五分钟，然后加入 500 uL 耗尽 EV 的 FBS 以停止反应。对于微囊泡，在4摄氏度下以16， 000×g离心30分钟。

弃去上清液。加入 1 mL PBS 冲洗残留物。再次离心，弃去上清液以除去未结合的染料。

对于微囊泡，在4摄氏度下以16， 000×g离心30分钟。用 200 uL PBS 重悬残留物。将20uL悬浮液滴在载玻片上，并在荧光显微镜下观察。

将细胞外囊泡重悬于200uL的PBS中，然后以10:1的体积比与肝素溶液混合。将鼠标放入尾静脉成像系统。按下开关提起拉杆。

在尾静脉插画师的帮助下，通过尾静脉系统地注射细胞外囊泡悬浮液。使用NTA对粒径分布的分析表明，来自人间充质干细胞的外泌体大小范围为40至335 nm，峰尺寸约为100 nm。此外，微囊泡的大小范围为50至445nm，峰尺寸为150nm。

外泌体的形态学特征表明它们表现出典型的杯形。通过PKH26有效地标记细胞外囊泡，通过大体视图观察到标记的沉淀以及荧光显微镜。操作人员在收集上清液时应注意，因为必须均匀吹动细胞才能完全收集间充质干细胞中保留的释放EV。

为了验证注射的成功，可以对荧光标记的EV或植入特定组织部位的冷冻切片的生物分布进行体内成像。