从原代细胞和培养细胞制备细胞质和核长RNA

该协议对于评估细胞核和细胞质中定义的生化元件的不同作用以及分析各种细胞系内这些结构域之间的细胞内相互作用是必要的。该技术利用常见的实验室设备和试剂更有效地分离细胞质和细胞核部分。该协议可以比其他协议更便宜，更快。

随着对细胞质和核相互作用的研究越来越广泛，定位对细胞内事件的影响可以得到更好的理解。可以分析细胞质和细胞核之间的交换，表明这些交换过程中的某些分子是否会导致癌症的发展，正如对核蛋白的研究表明的那样。方案中最关键的步骤是将裂解缓冲液的浓度修改为适当的浓度。

由于裂解缓冲液的使用在很大程度上取决于细胞膜的破坏，并且裂解缓冲液在不同细胞系上的有效性存在天然差异。首先，使用1.5毫升管在2000G下离心5分钟沉淀细胞，使用吸液管丢弃上清液。将沉淀重悬于300微升冰冷的裂解缓冲液中。

然后，在 12， 000 摄氏度下以大约 4 摄氏度的速度旋转试管两分钟。小心地除去上清液并将其放入新的1.5毫升管中。剩余的颗粒将是核部分。

接下来，向沉淀中加入 500 微升冰冷的 PBS，并在室温下以 2000 G 离心五分钟。为了确认使用qPCR分离区室，首先，使用市售试剂盒将RNA转化为互补DNA。准备逆转录酶预混液。

添加模板 RNA。在热循环仪中孵育反应。继续进行定量聚合酶链反应和分析。

首先用DEPC水稀释cDNA合成，最终浓度为每毫升20纳克。使用PCR预混液，使用手动说明制备每个样品的反应物。获取检测细胞质和细胞核分离所需的商业探针。

使用MALAT1作为核标志物，TUG1作为细胞质标志物。通过将单个样品的每个技术重复的每个组分乘以 3 来计算每个组分的体积。对于每个核和细胞质样品，用MALAT1获取核级分，用MALAT1获取细胞质级分，用TUG1获取核级分，用TUG1获取细胞质级分。

短暂涡旋以混合溶液，并将20微升混合物转移到光学反应板的每个孔中。用用于qPCR的透明粘合膜覆盖板，并短暂离心板以消除气泡，然后在室温下以300倍G旋转样品5分钟。使用设计和分析软件，为循环参数选择标准曲线。

使用 qPCR 软件，选择安装程序运行。在数据文件属性页上，选择方法和输入周期参数。输入循环参数后，选择板片并输入要运行的样品。

选择"开始运行"。运行完成后，使用样品名称、目标名称和定量周期创建数据电子表格。从MALAT1样品开始计算核分数。

从马拉特1核部分减去MALAT1细胞质部分。继续使用MALAT1样品以计算细胞质部分。从 MALAT1 细胞质部分中减去 MALAT1 核部分，然后计算两个升高到负 delta CQ 的分数。使用 TUG1 样本执行计算。

当TUG1作为细胞质元件的阳性对照存在时，预计细胞质分级水平将高于核分离水平。阴性结果，其中用MALAT1在样品中观察到细胞质分级分离水平。这表明从核级分中分离的RNA受到污染，可能是由于裂解浓度过低或过高。

MALAT1和TUG1与细胞核和细胞质分离的相关性最高，通过蛋白质印迹和RNA电泳证实，证实了样品的纯度和质量。此外，核提取物和细胞质提取物的纯度可以通过蛋白质印迹来证明，蛋白质印迹使用层粘连蛋白作为核级分的标记物，α-微管蛋白作为细胞质部分的阳性标记物。在细胞质RNA电泳中未观察到峰，表明细胞质RNA样品中质量高，污染很少或没有。

裂解缓冲液的使用对于适当的分级分离至关重要，将裂解缓冲液浓度优化为所需的目标细胞系至关重要。该技术允许对核和细胞质相互作用进行有针对性的研究，这广泛适用于各种研究主题，并允许更好地了解特定生物元素的定位如何与其功能相关。