非编码 RNA 通常具有多个等值形式。在体外过度表达研究中，通常很难研究所有这些表达的等同形。该技术允许用户直接从基因组中派生表达，使细胞能够表达特定非编码RNA的内源等异构。
这种强大的技术允许用户以保真度和准确性专门指导基因组中任何基因的表达。通过设计引导RNA到特定基因，一个人能够使用内源基因拼接机制来表达给定细胞中的天然异构体。演示这个程序将是罗伯特·兰金，一个博士后从我的实验室。
要设计位于转录开始位点100个碱基对内的引导RNA序列，请使用BLAT等基因数据库确保引导RNA是感兴趣的基因所独有。将导导RNA和停用的Cas9质粒储存在4摄氏度。用安比西林在卢里亚肉汤加糖盘上划出大肠杆菌，并在37摄氏度下一夜之间将细菌生长。
第二天，挑选一个菌落，用安霉素在五毫升的LB中生长细菌，在37摄氏度的培养箱中剧烈摇晃管子。第二天，在2升烧瓶中加入200毫升的细菌，用安霉素加入200毫升的LB中，在37摄氏度的培养箱中一夜之间剧烈摇动烧瓶。在3，724次g下旋转细菌20分钟，然后进行DNA纯化。
为了制造含有dCas9的扁病毒，首先涂上100毫升组织培养皿，配以5毫升0.01%的聚-L-莱辛和板500万个 HEK293T 细胞每盘在10毫升完整的Dulbecco的修改鹰中等， 然后通过混合10微克含LTR导导RNA载体或含LTR的停用Cas9载体与含有病毒成分的质粒来准备DNA转染样本。将水加入总体积为 450 微升的混合物，并通过连接到注射器的 0.2 微米滤片尖过滤混合物。接下来，在DNA的每个转染样品中加入50微升2.5摩尔二氯化钙，轻轻混合。
通过附着在注射器上 0.2 微米的滤波尖过滤钙-DNA 混合物。将 500 微升 2X HBS 移入五毫升聚苯乙烯管中。滴滴加入500微升的钙-DNA混合物，轻轻涡流。
在室温下孵育三分钟。在每个含 HEK293T 的组织培养盘中加入一毫升的 DNA 钙 HBS 悬浮液，并在 37 摄氏度的 5%二氧化碳培养箱中孵育。第三天，慢慢取出介质，然后丢弃盘子。
用 PBS 小心洗一次细胞。加入六毫升完整的DMEM，辅以20毫升的 HEPES 和 10 毫升的甲酸钠。然后在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞5至6小时。
孵育后，用PBS清洗细胞一次，在 HEK293T 细胞中加入5毫升完整的DMEM，用20毫升的 HEPES。在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞12小时。第四天，收集HK293T细胞中分，过滤含有病毒的上清液。
要开始病毒颗粒计数，首先通过添加 19 个部分蒸馏、去化水来稀释 P24 ELISA 试剂盒中的洗涤浓缩物。然后，使用 RPMI 1640 作为稀释剂，将该套件的正控从该套件稀释至每毫升 200 毫微克，然后根据 P24 ELISA 稀释表对 1.5 毫升管中的标准曲线进行稀释。为了测量样品中病毒的浓度，将样品稀释添加到96孔板的指定孔中，从1：1000稀释开始，并根据需要修改体积，以便在标准曲线范围内。
然后用Triton X-100稀释样品，最终浓度为0.5%，并将每个样品的200微升和RPMI 1640添加到指定的油井中。密封板并在37摄氏度下孵育两小时。每 1X 洗涤缓冲液中每井用 300 微升清洗板 6 次。
通过倒置盘子并在纸巾上敲击它来去除多余的液体。然后将100微升的检测器抗体从试剂盒添加到除基板空白以外的所有孔中。密封板，并在37摄氏度下孵育一小时。
清洗盘子，然后通过倒置盘子，用纸巾敲击它，去除多余的液体。为了测量检测器抗体，用SA-HRP稀释剂在1：100稀释马萝卜过氧化物酶。将稀释的SA-HRP彻底混合，并在除空白以外的所有孔中加入100微升。
在室温下密封并孵育板30分钟。接下来，用1X洗涤缓冲液清洗盘子，然后敲开多余的液体。将一个正苯二胺片滴在基板稀释剂的 11 毫升中，为一个板提供足够的基底溶液。
涡流 OPD 溶液大力溶解，并保护其免受光线的光。将 100 微升 OPD 基板溶液添加到包括空白在内的所有孔中。使用分光光度计，立即读取 450 纳米的吸光度。
以一秒间隔重复 10 次，然后进行平均测量。在T75烧瓶中，在5毫升的减少血清介质中，用聚布雷恩的5毫升中，重新发送和培养Jurkat T细胞。然后添加 HEK293T 条件介质，其中包含 100 万个包含 dCas9 的病毒颗粒。
用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。感染后三天，在233次g下旋转细胞5分钟，并在10毫升完整的DMEM中重新释放，并辅以纯霉素。培养T75烧瓶中的细胞，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育。
每三天一次，为期九天，以233次g旋转细胞，五分钟，用完整的DMEM代替用紫霉素补充的 DMEM。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。然后，在一个96井的盘子里，用组织培养处理的组织，在第一个井的100微升中加入1万个细胞，并辅以紫霉素。
使用完整的DMEM辅以紫霉素，对以下孔的内容进行1：1的连续稀释。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。将克隆细胞扩展成两个24孔板，然后将六孔板的两百万个细胞板板，用于三个克隆。
将其他三个孔的板板，以非转导的Jurkat细胞作为对控装置。最后，将细胞板入T75烧瓶中，将细胞放入细胞培养箱中过夜。要开始定量PCR测量基因表达，首先通过添加1微克RNA、4微升cDNA合成缓冲液和1微升逆转录酶到250微升管来合成补充DNA，然后将水加入20微升的最终体积。
然后，在 42 摄氏度下使用热循环器 30 分钟，在 95 摄氏度下使用 5 分钟，以灭活逆转录酶。合成后用60微升水稀释cDNA。在最终浓度为10微摩尔、5微升的SYBR绿色和4微升的cDNA时，每个前进和反向底剂含有0.5微升的管的运行聚合酶链反应。
最后选择在DMEM中的Jurkat-dCas9细胞，辅以海霉素B10天。向下旋转细胞，每三天更换一次介质。净化 RNAse 并转到 RT-qPCR。
在这项研究中，gRNA序列在10至100个碱基对内，远离转录开始位点，用于将Cas9激活复合物定向到 IFNG-AS1 的转录位点，这是一种与炎症性肠病相关的长非编码RNA。为了能够选择双传感器，使用双质粒系统将dCas9或gRNAse增强剂转换到细胞中。在这里，MS2蛋白质可增强 IFNG-AS1 的过表达。
已确认两个克隆的 Cas9 表达式。针对 HPRT1 的引土用于确认非转导细胞中存在 RNA。mRNA表达通过省略cDNA反应中的逆转录酶得到确认。
IFNG-AS1 的三个拼接变体可以通过特定于脚本的底像集或针对所有已知 IFNG-AS1 转录的底转集检测。所有荧光曲线都是指数的，内务基因HPRT1在控制和 IFNG-AS1 gRNA 表达细胞之间的半周期内达到指数相。所有已知 IFNG-AS1 转录的底片在实验之间检测最多，IFNG-AS1 表达的测量结果增加了 20 倍。
然而，IFNG-AS1的第三份记录显示，IFNG-AS1水平显著增加了5至10倍。为了积极过度表达你想要的基因，在步骤2.1中设计指南RNA对于协议的成功至关重要。此外，高质量的病毒颗粒的产生将确保协议组件的稳健表达。
一旦所需的基因被过度表达，可以进行功能研究来研究基因机制。在我们的示例中，我们选择在过度表达我们感兴趣的基因后查看细胞因子的产生。该技术最初由格里斯巴赫集团于2013年开发，并已被其他集团广泛应用和阐述。
我们很高兴地将这种技术应用于长非编码的RNA，以探索它们的特定功能。复制缺陷的扁病毒应在已被批准用于病毒工作的实验室中处理。此外，人类细胞系和大肠杆菌被认为是生物危害。
最后，重组DNA质粒应由训练有素的工作人员处理。
