视网膜组织中免疫染色半胱天冬酶-9的定量

该协议提供了一种详细的免疫组织化学方法来鉴定，验证和靶向复杂组织中功能相关的半胱天冬酶。该技术的主要优点是能够询问细胞类型特异性凋亡和非凋亡半胱天冬酶-9功能，并且可以应用于其他感兴趣的复杂组织和半胱天冬酶。了解半胱天冬酶的功能有助于扩展细胞生物学的当前知识，并且由于它们参与疾病，也有利于确定潜在的治疗靶点。

使用染色视网膜切片的共聚焦显微镜图像开始量化半胱天冬酶水平。为此，请将 405、470、555 和 640 通道的图像文件拖到斐济的控制台上。单击"图像"、"颜色"和"合并通道"选项卡，为文件指定颜色。

然后通过单击图像堆栈和 Z 项目来压缩 Z 堆栈。选择投影类型作为最大强度。通过单击图像打开通道的界面，然后单击颜色通道的工具。

接下来，打开亮度和对比度界面。要选择每个通道的参数，请转到通道的选项卡并选择一个通道。将光标放在背景顶部并注释像素值。

然后将光标放在半胱天冬酶表达的单元格上并注释像素值。要测试参数，请转到亮度和对比度界面，然后单击选择。插入最小显示值或半胱天冬酶表达单元格的像素值。

然后在单击确定之前插入最大显示值或背景像素值。从盲组织中选择随机图像，并重复选择每个通道的参数以测试所有通道的参数。设置参数后，打开图像文件，然后压缩 Z 堆栈。

添加半胱天冬酶通道的亮度和对比度参数以及血管标志物通道的异凝集素。使用点工具，使用血管标志物与半胱天冬酶表达的共定位作为阳性区域的读数来量化阳性血管区域的数量。然后使用钩子作为阳性神经元区域的标记，量化正血管区域的数量。

在电子表格上为每个图像注释值，并按部分平均值。平均截面值，这将是每只眼睛的读数。该方案确定了半胱天冬酶的细胞定位和半胱天冬酶表达的神经元视网膜层。

视网膜横截面允许视网膜神经节层或RGL，核间层或INL以及用钩子染色时外核层或ONL中的视网膜核的可视化。在横截面中，视网膜血管似乎断开，并在RGL和INL之间以及INL和ONL之间分离供应丛状层。视网膜横截面还确定了高度调控的半胱天冬酶-9，即视网膜静脉阻塞后一天。

半胱天冬酶-9抑制在降低内皮细胞敲除小鼠神经元半胱天冬酶-7表达方面更有效，验证了内皮半胱天冬酶-9的功能相关性。代表性分析表明，半胱天冬酶-9活性的抑制在药理学上阻断了半胱天冬酶-7在视网膜静脉阻塞后的表达。该技术的成功依赖于仔细的组织制备以及IHC和显微成像，以确保数据的一致性，有效性和可靠性。

该方法可与蛋白质印迹分析相结合，用于半胱天冬酶信号传导的半定量比较。该技术提供了询问RVO中靶向活性半胱天冬酶-9的治疗方法疗效的步骤。这种方法也可以应用于其他组织，包括大脑。