该协议提供了对细胞死亡过程激活的多方面理解，这可以提供对疾病机制的关键见解并为治疗策略提供信息。该协议依赖于使用更简单的技术，并从单个内源性细胞群中获取多个半胱天冬酶的激活，以极大地确定激活。先天免疫细胞死亡与整个疾病谱有关，从感染到炎症性疾病再到癌症。
通过半胱天冬酶活化了解细胞死亡的分子机制可以为疾病过程提供重要的见解。来自实验室的博士后研究助理Julieann博士将演示该程序。分离骨髓并分化BMDM后，用甲型流感病毒感染细胞。
计算 20 个斑块形成单位的多重感染所需的病毒量。从BMDM中取出培养基，并用500微升PBS洗涤细胞一次。向每个孔中加入450微升高葡萄糖DMEM中的甲型流感病毒，而无需加热灭活FBS，并将板在37摄氏度下在加湿培养箱中孵育一小时以使其吸收。
在一小时的孵育结束时，加入50微升热灭活的FBS，并将板以37摄氏度返回培养箱共12小时。孵育12小时后，从培养箱中取出板。吸出150微升上清液并丢弃或保存用于上清液分析。
不要除去剩余的上清液。现在，通过每孔混合 50 微升半胱天冬酶裂解缓冲液和 100 微升四个 XSDS 缓冲液来创建蛋白质收集溶液。然后，向每个孔中加入150微升混合物。
对于每个孔，移液混合物以收集裂解的细胞和上清液。移液时，用移液器吸头刮孔底部以破坏细胞。刮擦和移液后，将蛋白质裂解物收集到标记的1.5毫升管中。
使用加热块将所有管子加热到 100 摄氏度 12 分钟。从加热块中取出试管，并在室温下以14， 500 G离心30秒以沉淀任何不溶性成分。用12%聚丙烯酰胺凝胶制备电泳仪，共10孔。
用电泳缓冲液填充电泳设备并取出凝胶梳。然后，将样品在 100 摄氏度下加热五分钟。上样前，将样品在室温下以 14， 500 G 离心 30 秒。
然后，将30微升样品缓慢加载到每个孔中。使用组合的上清液和蛋白质裂解物和半胱天冬酶裂解缓冲液或组织匀浆进行半胱天冬酶1，3，7和8印迹，并使用协议中描述的蛋白质裂解物DN RIPA缓冲液或组织匀浆用于半胱天冬酶11和9。要同时评估所有六种半胱天冬酶，请使用相同的程序将相同的样品加载到六种凝胶中的每一种中。
将电泳设备连接到电源，并将电源设置为 80 伏 20 分钟以开始凝胶电泳。最初的 20 分钟后，将电源调整为 100 伏，持续 45 到 60 分钟。观察染料正面。
一旦染料前沿到达凝胶底部，关闭电源。在凝胶电泳时，按照手稿中的说明制备转印缓冲液。每次都使溶液新鲜。
使用凝胶释放器从电泳装置中取出凝胶。要设置凝胶的转印膜组，请将PVDF膜浸泡在甲醇中一分钟来激活PVDF膜。预润湿两张滤纸、凝胶、PVDF膜和转印缓冲液五分钟。
在这五分钟的孵育过程中，将PVDF膜和凝胶保存在单独的容器中。开始在半干式系统上组装传输堆栈。在底部铂纳米侧，放置一张滤纸，PVDF膜，凝胶，最后放置一张滤纸。
轻轻地滚出或压出各层之间的气泡，然后关闭系统的顶部。现在，连接到电源。将电源设置为 25 伏，持续 40 分钟。
转移后，拆卸转移堆栈，收集膜，并将其放入方形培养皿中。接下来，通过加入 15 毫升 5% 脱脂牛奶溶液进行膜封闭，并将膜在室温下以 50 至 70 RPM 的摇床孵育一小时。孵育后，除去封闭溶液，加入10毫升稀释的抗体溶液，并在室温或4摄氏度下在摇床上孵育2小时，如前所述。
然后，收集抗体溶液，并在室温下在摇床上向膜中加入15毫升TBST洗涤膜10分钟。丢弃 TBST。用15毫升TBST重复洗涤三次。
加入10毫升稀释的二级HRP偶联抗体溶液。在室温下在摇床上孵育一小时。在孵育结束时，一旦除去抗体溶液，通过在室温下在摇床上加入15毫升TBST洗涤膜10分钟。
完成洗涤步骤并去除TBST后，加入10毫升高灵敏度HRP底物。让它在室温下静置一分钟。从基材上取下膜。
使用化学发光成像仪直接进行成像，并将附件白色反式托盘插入下部位置。使用自动曝光模式曝光膜。分析甲型流感病毒感染后野生型和ZBP1突变体的前体和活化半胱天冬酶1、11、3、7、8和9，HSV1感染后的野生型和AIM2突变体，以及新弗朗西斯菌感染，或脂多糖和ATP刺激后的野生型和NLRP3突变体BDM。
缺乏上游PANoptosis传感器的细胞不会响应同源PANoptosis诱导的刺激而经历强烈的细胞死亡。甲型流感病毒感染诱导ZBP1-PANoptosome的形成，并且在甲型流感病毒感染期间，ZBP1缺陷细胞受到显着保护，免受细胞死亡。同样，HSV1和Francisella novicida感染诱导AIM2 PANtosome的形成，并且AIM2缺陷细胞无法响应这些感染而经历强烈的细胞死亡。
缺乏上游炎症小体传感器的细胞受到保护，免受细胞死亡以响应其各自的刺激，并且NLRP3缺陷细胞不会响应脂多糖和ATP而发生细胞死亡。重要的是要记住制备两种细胞裂解物的混合物以确定特定的半胱天冬酶。装载射流后，发光样品应储存在零下20度，以保持半胱天冬酶目标的完整性以进行跟进 结合该协议，实时细胞死亡成像或LDH测定可用于监测细胞死亡的执行，并且ELIZA可用于检查细胞因子或DAMPs的释放从经历不同类型细胞死亡的细胞。
