该协议通过优化流式细胞术分选参数，为小细胞外囊泡提供了一种快速且尺寸特异性的解决方案方法。这些优化提供了一个关键分类设置面板，使人们能够使用前向散射而不是仅使用大小散射获得具有代表性的小细胞外囊泡群体。首先执行流通池分选仪的标准启动程序。
按启动按钮打开机器，然后单击激光控制面板上的激光电源按钮。按下智能进样器子菜单上的更换罐按钮，对流体进行加压。使用超声波清洁的 50 微米喷嘴和空气喷嘴，并将其安装到喷嘴组件上。
在压力控制台上将鞘液的压力调节为 80 SI，将样品流量的压力调节为 80.3 SI。按下启动护套流按钮，启动护套流。点按"智能进样器"子菜单中的气泡按钮以自动去气泡 10 分钟，然后将其关闭。
要对齐流并确定激光光斑，请打开照明室灯以查看针孔上的流。调整上下、左右、前后千分尺，使流在针孔上居中并聚焦流。打开所有激光快门，选择激光和流截距选项卡，然后根据提示连续按下绿色箭头按钮，完成激光截距和喷嘴对准校准过程。
访问精细的激光对准屏幕。选择 640 纳米激光器和 772 bar 44 带通通道作为 x 轴参数，选择 405 纳米激光器和 448 bar 59 带通通道作为 y 轴参数。按下触发参数选择器，然后选择488纳米激光器的前向散射参数。
接下来，通过将一滴加入一毫升双蒸水中至终浓度为每毫升 1 倍 10 至第六颗珠子来稀释彩虹荧光颗粒。打开样品室门并加载一管准备好的彩虹荧光颗粒。按下起始样品按钮并上下调整千分尺以优化荧光强度，使每个信号尽可能强烈。
按下触摸屏控制面板上的开始质量控制或质量控制按钮以自动执行质量控制。然后按智能排序初始化按钮。仪器自动调整液滴振荡的频率和幅度，以获得大约25的液滴延迟，并能够清楚地看到液滴的断裂点。
接下来，按下降延迟按钮和维护按钮。选择管子作为排序输出类型。将 15 毫升管架放入分拣室中。
打开板电压并将板电压设置为大约 4， 000 伏。接下来，通过选择流设置按钮打开测试模式。调整充电相位滑块和偏转滑块，以确保流的图像与收集管对齐。
然后选择复选标记按钮。在计算机上登录到 Summit 工作站。从文件主菜单创建新协议。
然后，通过在 Summit 软件控制面板中选择直方图选项卡来创建点图。选择前向散射作为 x 轴参数，选择侧散射作为 y 轴参数。然后右键单击工作区中新点图的轴，并以对数形式显示前向散射和侧散射。
选择采集选项卡并找到采集参数面板。启用启用参数子菜单中的所有信号。选择前向散射作为触发参数，并将阈值设置为0.01。
将前向散射和侧向散射的电压和增益调整为 250 和 0.6，以确保前向散射图与侧向散射图中的事件和群体分开。通过将一微升微球加入一毫升双蒸水中，将荧光聚苯乙烯微球稀释成 100、200 和 300 纳米悬浮液。然后依次加载微球悬浮液。
在峰会软件的采集菜单下选择开始，记录20， 000个事件，记录事件后点击停止。右键单击前向散点图与侧散点点图以创建矩形并拖动以调整大小。通过右键单击这些区域来重新定位电子噪声和 100 纳米微球群的区域，将它们分别重命名为 R7 和 R4。
重复上述步骤，依次用矩形框住200纳米和300纳米微球，并分别将其重命名为R5和R6。最后，根据电子噪声和200纳米粒子的位置确定50至200纳米的分选区域，将其定义为R8。在排序逻辑和统计信息面板中编辑排序决策，方法是双击左侧流或 L1 流的空白字段，然后选择名为 R8 的区域以创建排序逻辑。选择中止纯度模式，并为L1流选择高于一滴的液滴包络。
加载先前制备的细胞外囊泡或EV混合物的500微升样品。按 Summit 中采集菜单下的"开始"按钮获取数据，然后单击"停止"。接下来，按排序菜单中的开始，将 50 至 200 纳米大小的小细胞外囊泡或 sEV 收集到 15 毫升离心管中。
对标准尺寸的聚苯乙烯微球进行流式细胞术分析，以定位前向散射与侧向散射图中的50至200纳米尺寸范围，揭示了可区分的颗粒信号。R4、R5 和 R6 分别指 100、200 和 300 纳米颗粒的位置。R7是电子噪声作为50纳米颗粒的检测限，R8表示50至200纳米颗粒的位置范围。
通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）从胰腺一细胞中提取的EVs混合物的粒度分布在超速离心后的40至400纳米的宽范围内。进行流式细胞术分选以分离和纯化R8区域内的50至200纳米sEV。通过NTA验证了分离质量，发现分选后的sEV粒径范围在50-200纳米之间。
通过TEM进一步观察到sEV的存在，并通过蛋白质印迹分析确认分离的sEV含有CD6，CD63和CD81的标志物。该方法允许分离小细胞外囊泡和小细胞外囊泡基因表达的分类或专业分析，开辟了许多下游研究应用。
