Bu protokol, akış sitometrisi sıralama parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir çözüm yöntemi sağlar. Bu optimizasyonlar, yalnızca boyut saçılımına karşı ileri saçılma kullanarak küçük hücre dışı veziküllerin temsili popülasyonlarını elde etmeyi sağlayan kritik sıralama ayarlarının bir panelini sağlar. Akış hücresi sıralayıcısının standart başlatma yordamını gerçekleştirerek başlayın.
Başlangıç düğmesine basarak makineyi açın, ardından lazer kontrol panelindeki lazer güç düğmesini tıklayın. Akışkanları basınçlandırmak için Smart Sampler alt menüsündeki tankları değiştir düğmesine basın. Ultrasonik olarak temizlenmiş 50 mikrometre jet ve hava nozulu kullanın ve nozul tertibatına takın.
Basıncı, kılıf sıvısı için 80 SI'ye ve basınç konsolundaki numune akışı için 80,3 SI'ye ayarlayın. Kılıf akışı akışını başlatmak için kılıf akışını başlat düğmesine basın. Akıllı Örnekleyici alt menüsündeki kabarcık düğmesini tıklatarak 10 dakika boyunca otomatik olarak kabarcıktan arındırın ve ardından kapatın.
Akışı hizalamak ve lazer noktasını belirlemek için, akışı iğne deliklerinin üzerinden görüntülemek üzere aydınlatma odası ışığını açın. Akışı iğne deliğinde ortalamak ve akışı odaklamak için yukarı ve aşağı, sol ve sağ, ön ve arka mikrometreleri ayarlayın. Tüm lazer deklanşörlerini açın, lazer ve akış önleme sekmesini seçin ve ardından lazer durdurma ve nozul hizalama kalibrasyon işlemini tamamlamanız istendiğinde yeşil ok düğmesine sürekli basın.
İnce lazer hizalama ekranına erişin. X ekseni parametresi olarak 640 nanometre lazer ve 772 bar 44 bandpass kanalını ve y ekseni parametresi olarak 405 nanometre lazer ve 448 bar 59 bandpass kanalını seçin. Tetik parametresi seçiciye basın ve 488 nanometre lazerin ileri saçılma parametresini seçin.
Daha sonra, gökkuşağı floresan parçacıklarını, bir mililitre çift damıtılmış suya bir damla ekleyerek, mililitre başına bir kez 10 ila altıncı boncuk nihai konsantrasyonuna kadar seyreltin. Numune odası kapısını açın ve hazırlanmış gökkuşağı floresan parçacıklarından oluşan bir tüp yükleyin. Numuneyi başlat düğmesine basın ve floresan yoğunluğunu optimize etmek için mikrometreleri yukarı ve aşağı ayarlayarak her sinyali mümkün olduğunca yoğun hale getirin.
QC'yi otomatik olarak gerçekleştirmek için dokunmatik ekran kontrol panelindeki kalite kontrolünü başlat veya QC düğmesine basın. Ardından IntelliSort başlatma düğmesine basın. Cihaz, yaklaşık 25'lik düşme gecikmesini elde etmek ve damlanın kopma noktasını net bir şekilde görselleştirebilmek için damlacık salınımının frekansını ve genliğini otomatik olarak ayarlar.
Ardından, bırakma gecikme düğmesine ve bakım düğmesine basın. Sıralama çıktısı türü olarak tüpü seçin. Sıralama odasına 15 mililitrelik bir tüp tutucu yerleştirin.
Plaka voltajını açın ve plaka voltajını yaklaşık 4.000 volta ayarlayın. Ardından, akış kurulumu düğmesini seçerek test desenini açın. Akışın görüntüsünün toplama tüpüyle aynı hizada olduğundan emin olmak için şarj fazı kaydırıcısını ve sapma kaydırıcısını ayarlayın.
Ardından onay işareti düğmesini seçin. Bilgisayardaki Summit iş istasyonunda oturum açın. Dosya ana menüsünden yeni bir protokol oluşturun.
Ardından, Summit Software kontrol panelindeki histogram sekmesini seçerek bir nokta grafiği oluşturun. X ekseni parametresi olarak ileri saçılma ve y ekseni parametresi olarak yan saçılma seçin. Ardından, çalışma alanındaki yeni nokta grafiğinin eksenine sağ tıklayın ve ileri saçılma ve yan saçılma logaritmik biçimde sunun.
Alma sekmesini seçin ve alma parametreleri panelini bulun. Parametreleri etkinleştirme alt menüsündeki tüm sinyalleri etkinleştirin. Tetikleyici parametre olarak ileri dağılım'ı seçin ve 0,01 eşiğini ayarlayın.
İleri saçılma ve yan saçılma grafiği ve popülasyonları arasındaki olayların ayrılmasını sağlamak için ileri saçılma ve yan saçılmanın voltajını ve kazancını 250 ve 0,6'da ayarlayın. Floresan polistiren mikrosferleri, bir mililitre çift damıtılmış suya bir mikrolitre mikrosfer ekleyerek 100, 200 ve 300 nanometre süspansiyonlara seyreltin. Ardından mikrosfer süspansiyonunu art arda yükleyin.
20.000 olayı kaydetmek için Summit Software'in satın alma menüsü altında Başlat'ı seçin ve ardından olayları kaydettikten sonra Durdur'u tıklatın. Dikdörtgenler oluşturmak için ileri dağılım ve yan dağılım nokta grafiğine sağ tıklayın ve yeniden boyutlandırmak için sürükleyin. Elektronik gürültü bölgelerini ve 100 nanometre mikrosfer popülasyonunu, sırasıyla R7 ve R4 olarak yeniden adlandırmak için bölgelere sağ tıklayarak yeniden konumlandırın.
200 ve 300 nanometre mikrosferleri art arda dikdörtgenlerle çerçevelemek için adımları tekrarlayın ve bunları sırasıyla R5 ve R6 olarak yeniden adlandırın. Son olarak, elektronik gürültüye ve R8 olarak tanımlamak için 200 nanometre parçacıklarının konumuna dayanarak 50 ila 200 nanometre sıralama bölgesini belirleyin. Soldaki veya L1 akışının boş alanına çift tıklayıp sıralama mantığını oluşturmak için R8 adlı bölgeyi seçerek sıralama mantığını ve istatistikleri panelinde sıralama kararlarını düzenleyin. Saflığın iptal modunu seçin ve L1 akışı için bir damlanın üzerinde bir damlacık zarfı seçin.
Önceden hazırlanmış hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin karışımının 500 mikrolitrelik örneğini yükleyin. Verileri almak için Summit'teki edinme menüsünün altındaki Başlat düğmesine basın ve ardından Durdur'u tıklatın. Ardından, 50 ila 200 nanometre boyutunda küçük hücre dışı vezikülleri veya sEV'yi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplamak için sıralama menüsünde Başlat'a basın.
İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde 50 ila 200 nanometre boyut aralığını bulmak için standart boyutlu polistiren mikrosferlerin akış sitometrisi analizi, ayırt edilebilir parçacık sinyallerini ortaya çıkardı. R4, R5 ve R6, sırasıyla 100, 200 ve 300 nanometre parçacıklarının konumlarını ifade eder. R7, 50 nanometre parçacıkları için algılama sınırı olarak elektronik gürültüdür ve R8, 50 ila 200 nanometre parçacıklarının konum aralığını temsil eder.
Pankreas hücrelerinden nanopartikül izleme analizi veya NTA ile türetilen EV'lerin karışımının parçacık boyutu dağılımı, ultra santrifüjlemeden sonra 40 ila 400 nanometre aralığındaydı. R8 bölgesindeki 50 ila 200 nanometre sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için akış sitometrik sıralama yapıldı. İzolasyon kalitesi NTA tarafından doğrulandı ve sıralamadan sonra sEV'nin parçacık boyutu aralığının 50 ila 200 nanometre arasında olduğu bulundu.
sEV'nin varlığı TEM tarafından daha da gözlendi ve izole edilen sEV'lerin Western Blot Analizi ile CD6, CD63 ve CD81 belirteçleri içerdiği doğrulandı. Bu yöntem, küçük hücre dışı veziküllerin ayrılmasına ve küçük hücre dışı veziküllerin gen ekspresyonunun sınıflandırılmasına veya protem analizine izin verir ve çok sayıda aşağı akış araştırma uygulamasına yol açar.
