小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的分离

该协议的总体目标是提出一种优化的方法，用于在部分肝切除术后小鼠中分离肝细胞，而无需密度梯度离心。我们通常在早期再生期间看到很大比例的脂质肝细胞。由于密度低，通常在密度梯度离心时丢失的那些脂肪性肝细胞通过该方案保留。

要准备灌注设备，请使用鲁尔锁连接器将 26 号IUI插管连接到管道的出口端。然后冲洗管路并将管子的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲管中。用温热的灌注缓冲液以每分钟三毫升的泵速灌注。

在进行手术之前，请确保小鼠已充分麻醉。然后用手术磨砂液和70%乙醇清洁腹部。然后切断缝合线以重新打开先前为部分肝切除术制作的中线切口，并轻轻地将伤口边缘拉开。

如果肝切除术超过 24 至 48 小时，请拆下缝合线并用剪刀或手术刀割破皮肤。使用牵开器或简单的夹子保持腹部开放。腹腔应尽可能暴露，以优化通道和可视化。

将5-0聚丙烯缝合线固定在胸骨上。用头拉它并将其固定在这个位置。使用无菌棉签将肠道向右移动，以显示门静脉和腔静脉。

用湿布保留肠道。在鼠标后腿附近放置一个大约两厘米高的重物，例如金属配重环。然后将带有连接的 26 号IUI插管的管子放在物体上，并将针头小心地放在腔静脉顶部。

根据需要调整管子的长度。将胶原酶储备溶液转移到预热的消化缓冲管中。每只动物准备10至20毫升的消化缓冲液。

将泵速调整为每分钟三毫升后打开泵。缓冲液到达针头后，丢弃前两到三毫升预热的灌注缓冲液。要对下腔静脉进行插管，请使用无菌棉签轻轻地将腔静脉向穿刺下方的尾部拉动，以便提供的张力有助于将套管插入静脉。

将 26 号IUI插管以浅角度插入肾脏下方的下腔静脉，同时缓冲液穿过针头。确保针斜面朝上。当针头进入管腔时，在导管的闪光腔中寻找血液。

将针头再推进两到三毫米，以确保导管尖端进入静脉。将塑料导管滑过针头并再滑入腔静脉五毫米。缓慢而小心地取出针头。

两到三秒后，寻找肝脏中形成的白点或门静脉肿胀，这表明灌注缓冲液流经肝脏并从中央静脉进入肝小叶。等待门静脉在肝脏表面形成白点的一到两秒内明显肿胀。用剪刀尽可能远离肝门切断门静脉。

将流速增加到每分钟四到七毫升，具体取决于动物的体重、肝脏大小和初始肝切除术的程度。用镊子或血管夹夹住门静脉 7 到 10 秒钟。确保没有液体通过。

大约 30 秒后进行第二次钳夹，并确保肝脏肿胀和放松。继续冲洗动物三到四分钟，观察从门静脉流出的透明缓冲液。在消化缓冲液到达肝脏之前夹住门静脉三到四秒钟。

确保在释放钳夹时肝脏放松，并且灌注液保持清澈。一旦消化缓冲液到达肝脏，再次夹住门静脉。释放钳夹后，肝脏不应放松。

以每分钟五毫升的流速消解约四分钟。随着消化的进展，寻找肝脏开始肿胀的迹象和肝脏表面的小透明切片。观察肝脏呈现出湿布的质地，看起来几乎湿透。

用湿的无菌棉签小心地触摸稠度，以探测稠度。继续灌注，直到可以观察到肝脏表面纹理的显着差异。观察到肝脏呈现非常浅的颜色和气泡外观，表明Glisson的囊与实质分离。

一旦肝脏获得这些特性，就停止消化。在空气进入肝脏之前取下针头。用镊子抓住叶之间的中央结缔组织，并将其作为锚点轻轻向上提起。

切断肝脏与其他器官的所有连接并切除胆囊。轻轻地从腹腔中取出肝脏。要小心，因为在这个阶段它会很脆弱。

将肝脏放入冰冷的保存缓冲液中。将肝脏转移到10厘米的培养皿中，并在肝脏表面的几个位置加入10毫升冰冷的威廉姆斯中等E.破裂Glisson胶囊。用两把镊子抓住中央部分。

慢慢将它们拉开，让胶囊撕裂而不损坏肝细胞，并通过轻轻摇动胶囊来释放细胞。通过 100 微米细胞过滤器将 5 毫升肝髓过滤到 50 毫升管中。用10毫升新鲜冰冷培养基冲洗过滤器，并通过细胞过滤器过滤剩余的5毫升纸浆。

在 4 摄氏度下以 50 G 离心提取物五分钟。吸出大部分上清液，留下一毫升通过轻轻旋转管来重悬细胞。加入40毫升冷威廉姆斯E培养基，重复该步骤三次。

按照文本手稿中的说明继续分离肝细胞。在小鼠肝切除术70%后，最终肝细胞产量约为10至15×10至第6，平均最终活力为78%。在延长86%肝切除术后，肝细胞产量为4至9×10至第6，平均存活率为65%。

部分肝切除术后，与正常肝脏相比，肝细胞显示出与脂质含量增加相对应的增加的细胞大小。在肝部分切除术后24小时观察到小鼠肝细胞中脂质含量增加，这被视为粒度增加或通过增大的肝细胞内存在脂质囊泡直接观察到。在使用经典的密度梯度纯化方法时，上清液中丢失了大的脂肪肝细胞，细胞沉淀中仅收集了较小的瘦肝细胞。

通过改进的方案，脂质填充的肝细胞不会丢失，并且所有肝细胞都被沉淀。重复夹紧有助于冲洗过程。这样，肝脏就可以最好地清除可能抑制消化酶的剩余血液成分。