离体 尿路上皮细胞中机械活化的CA²⁺ 瞬变分析

该协议描述了一种在离体尿路上皮制剂中研究机械诱发钙事件的技术。该技术相对容易执行，并且可以适用于研究其他天然组织制剂中的机械诱发钙事件。通过将毛细管玻璃放入拉拔器中并使用毛细管固定旋钮进行调整来制造微量移液器。

按照制造商的说明分两步拉动玻璃毛细管。使用微锻件关闭微量移液器的吸头，加热器调节旋钮设置为 60。暴露安乐死小鼠的膀胱和盆骨后，裂开盆骨露出尿道，并用24号导管插管尿道。

使用 6-0 缝合线将导管固定在尿道上。收获膀胱和尿道，并将它们固定在浸泡在记录溶液中的硅橡胶支架垫上。用细镊子将膀胱粘膜与下面的肌肉层分开。

切开膀胱粘膜并将其固定下来，尿路上皮朝上硅胶弹性体插入物，位于直径为 35 毫米的组织培养皿底部。将带有固定膀胱粘膜的组织培养皿安装在配备带有电阻加热元件的培养皿培养箱的显微镜载物台中。用在线加热器在37摄氏度下加热的记录溶液以每分钟1.7毫升的速度连续灌注细胞培养皿。

使用双通道双极温度控制器将组织培养箱和溶液的温度保持在约37摄氏度。要记录机械诱导的钙离子瞬变，请将微量移液器浸入记录溶液中。在明场照明下，使用低倍率扫描物镜将微量移液器移动到视场中心。

在垂直平面上移动显微操纵器并调整焦点以将移液器移动到尿路上皮组织表面附近。切换到具有适合免疫荧光的更高放大倍率和数值孔径的物镜。将显微操纵器设置为精细，并将移液器移动到目标细胞顶部附近。

如有必要，调整移液器的焦点和位置。在电生理学软件中打开刺激协议并设置播放。调整焦点并在实验管理器中按开始以启动数据采集。

这将驱动压电致动器并生成包含实验图像的文件。当细胞受到刺激时，观察到荧光的增加。要量化荧光强度，请在成像软件中打开图像文件并选择计数和测量窗口。

播放电影以识别受刺激的细胞。选择多边形工具并在戳的单元格的边界上绘制 ROI。转到测量窗口，选择强度配置文件，将测量设置为加班，将结果设置为平均值，将背景减法设置为无，然后按执行。

平均荧光强度将随时间计算。要导出强度曲线数据，请单击强度曲线结果窗口中的Excel图标，并使用科学图形和数据分析软件执行数据分析。在这项研究中，戳伞细胞以评估机械诱发的钙瞬变。

在10秒处捕获的图像显示了位于表达荧光钙传感器GCaMP5G的伞形电池顶部的刺激移液器的荧光图。对表达钙传感器的伞状细胞的机械刺激导致变形，然后荧光发射迅速增加。该图显示了几个细胞的荧光强度随时间变化。

戳戳在大多数用荧光钙传感器转导的伞状细胞中引起钙反应。最重要的一步是收集膀胱和尿道，然后将它们固定在硅橡胶支架垫上。在将膀胱粘膜与下面的肌肉层分离时避免组织损伤。

诸如此处描述的成像方法可以提供独特的见解，了解机械激活通道如何在其天然环境中发送变化并产生生理反应。