脐带血组造血干细胞的外活扩张为HSC在再生医学和移植治疗中的应用大有希望。该协议使用细胞因子鸡尾酒与丙酸处理相结合，迅速扩大大量功能性HSC，其特性与原基HSC相似。 由于丙酸治疗的迅速效果，这种方法还具有克服与基因编辑相关的HSC损失的潜力。
这种方法可能有助于在一段时间内产生与当前使用的基因修饰协议相关的更高数量的转基因细胞。丙酸外体膨胀协议相对简单可靠。使用细胞分离器设备纯化CD34阳性细胞具有高度可重复性和快速性，允许快速恢复高度纯化的CD34阳性细胞。
在从脐带血分离CD-34阳性细胞前24小时，通过添加两毫升0.5摩尔EDTA和33毫升7.5%BSA至465毫升1X PBS来准备分离缓冲液。轻轻混合缓冲液，并在四摄氏度下保持过夜。在净化当天，将介质加热到室温。
将整个脐带血单元分配到75平方厘米的烧瓶中。在室温下用等量的PBS稀释血液，轻轻混合。接下来，确定处理整个脐带血单元所需的管数。
向每个管中加入 15 毫升密度梯度介质。在密度梯度上缓慢地分配稀释的血液，同时以 45 度角将管进行分配，以创建两层。以 400 g 离心管 30 分钟，以较低的加速和减速速率。
离心后，单核细胞将位于等离子体和密度梯度介质层之间的白层中。小心地将抛光涂层层转移到新的 50 毫升管中。将同一脐带血单元中所有单核细胞收集到50毫升管中，直至达到25毫升。
在含有25毫升单核细胞的管子中加入25毫升的冷PBS，并混合良好。在400克和4摄氏度下离心10分钟。小心吸制上清液，将细胞颗粒重新在 50 毫升的冷 PBS 中。
在此之后，取出20微升的细胞悬浮液进行计数。使用自动细胞计数器计算沾有丙氨酸或碘化丙二丁的细胞数，并计算单核细胞的总数。然后，在400克和4摄氏度下将细胞离心15分钟。
首先，将300微升分离缓冲液与100微升人类FCR人类IgG和100微升CD34磁珠混合，从1000万个单核细胞中分离CD34阳性细胞。接下来，小心地从一根先前离心的单核细胞中去除上半代。每1000万个细胞使用500微升将颗粒重新悬浮在磁珠溶液中。
轻轻混合，在4摄氏度下孵育30分钟。在孵化过程中，准备细胞分离器设备，将存储溶液替换为工作缓冲器，然后运行洗涤程序，然后进行冲洗程序。然后，将运行缓冲液的冷细胞分离器添加到包含细胞混合物的管中，直到管完全充满。
在400克和4摄氏度下将管子离心15分钟。利用每1000万个细胞的两毫升，在冷分离器运行缓冲液中吸升和重新暂停细胞颗粒。将两毫升细胞悬浮液混合物转移到15毫升管中。
将三组管子装入电池分离器机架，该机架已预冷却至 4 摄氏度。一组管子包含MMC，第二组管子将用于收集负分，第三组管子将用于收集纯化CD34阳性细胞。将机架加载到单元分离器设备中并运行预设程序。
在此之后，在400g和4摄氏度时将含有正分数的管离心15分钟。吸制上清液，将纯化的CD34阳性细胞重新在一毫升无血清介质中。然后，使用自动细胞计数器来计算沾有丙氨酸或碘化丙二的细胞。
首先，准备足够的介质，以每毫升33，000个细胞的密度对纯化的CD34阳性细胞进行板板。将纯化的CD34阳性细胞在12井板中，在5万个细胞密度下，每井1.5毫升培养。在37摄氏度的20%二氧化碳加湿孵化器中孵育16小时。
在培养物中加入丙酸，使最终浓度为一毫摩尔。在相同条件下继续培养细胞，再培养七天。在该外体协议中，从脐带血分离出的CD34阳性细胞产生的原生造血干细胞数量增加。
仅使用细胞因子鸡尾酒治疗的培养物中，核细胞总数显著增加。尽管总核细胞数量较高，但与使用细胞因子鸡尾酒和丙酸治疗的培养物相比，仅接受细胞因子鸡尾酒的培养物中造血干细胞的数量仍然很低。在用细胞因子鸡尾酒和丙酸组合处理的培养物中，造血干细胞数量最大。
特别是，最大的膨胀是在五到七天后，用丙酸治疗后达到。造血干细胞数量的增加与造血干细胞百分比的迅速增加有关，在用丙丙酸治疗的24小时内，这一比例是显著的。虽然在外体培养的前四天保持百分比的增加，但经过五至七天的治疗后，该百分比逐渐下降。
然而，这种减少与造血干细胞绝对数量的增加成反比。造血干细胞在经过丙酸处理培养物中所占的百分比迅速上升，是由于获得CD90表型。CD34阳性细胞表达CD90表型标记达到近40-50%的细胞扩大在外体培养物治疗细胞因子鸡尾酒和丙酸四天。
然后，缺乏CD90标记表达的高纯化CD34阳性细胞的外体扩张证实了CD90表型的获取。在24小时内的丙酸治疗，近75%的外体扩张细胞表达CD90。这种表型在这些文化中的头四天被高度保留。
稀释的脐带血应在密度梯度上非常缓慢地分配，同时以 45 度角将管保持，以创建两个不同的层。遵循这个外体扩张程序，扩大的细胞可以注射到骨髓扩张的免疫缺陷NSG小鼠，以测试其功能和感染潜力。扩展的细胞可用于测试有关人类和小鼠HSC生物学以及不同基因或关键玩家在HSC功能完整性中的作用的多种问题。
使用这种技术，人体脐带血单元的外体扩大HSC的功能将很快在需要全源骨髓移植的血液恶性肿瘤患者的临床试验中得到测试。这项技术还使我们能够研究VPA治疗的外体扩张背后的机制，并深入了解原始HSC的生物学。
