使用荧光素-异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

这种方法有助于回答有关疾病是否会改变肠道屏障完整性的问题，或者潜在治疗是否可以维持肠道屏障完整性的问题。该技术的主要优点是它提供了一种非侵入性、低负担的技术来评估和量化体内肠道通透性。首先，将小鼠禁食四小时，然后使用38毫米22号灭菌弯曲管饲针通过口服强饲法向每只小鼠施用200微升FITC-葡聚糖悬浮液。

在第一次管饲后启动计时器，并在每次管饲之间等待 5 到 10 分钟以允许体内测量，保持管饲后一小时。将剩余的FITC-葡聚糖悬浮液保留为标准曲线。单击并按住启动按钮启动机器和软件，让系统预热。

单击设备状态并确保所有配置的设备都显示“正常”，然后再继续。然后单击“新建研究”并使用所需名称保存文件。接下来，单击学习选项。

输入样品 ID 并选择正确的激光器并进行实验。然后使用电动剃须刀从腹部去除皮毛，并在眼睛上大量涂抹兽药膏以防止干燥。打开成像室并将动物背侧放在扫描板上。

然后用胶带固定四肢和尾巴。接下来，使用“绘图”工具选择要扫描的区域。确保包括从肝脏上方到直肠的整个腹部宽度。

然后点击 修改 绘制后调整区域的工具。将扫描分辨率设置为 2.0 毫米，然后单击开始开始扫描。接下来，通过在所选文件名下找到图像文件来打开它们，并同时打开具有同步设置的所有文件。

使用图像设置工具栏，使用同步图像和同步比例按钮同步图像设置以进行准确比较。然后使用调整后的刻度保存图像。使用与成像系统关联的软件在均匀缩放的图像上比较每只动物和对照小鼠的腹部荧光。

管饲后四小时在无菌管中收集每只小鼠的粪便沉淀。然后将管子放在冰上并将它们放在黑暗中。接下来，在室温下以9， 390 x g 离心血液样品10分钟。

然后将血浆转移到新的无菌管中，并在黑暗中将其放在冰上。在200微升PBS中稀释50毫克粪便样品，并用PBS以一比二的比例稀释血浆。将100微升样品和标准品铺在不透明的黑色96孔板中。

在荧光板读数器上读取荧光，激发为485纳米，吸收为530纳米。最后，通过将荧光与标准曲线的已知浓度进行比较，确定每个样品中 FITC-葡聚糖的浓度。体内荧光分析表明，与接受菊粉补充饮食的小鼠相比，仅接受对照日粮的小鼠肝脏摄入的FITC-葡聚糖和腹腔中残留荧光水平更高。

与仅接受对照饮食的小鼠相比，接受菊粉补充饮食的小鼠血浆中FITC-葡聚糖水平显着降低。一致地，接受菊粉饮食的小鼠粪便中FITC-葡聚糖的含量明显高于仅接受对照饮食的小鼠。受控小鼠粪便中FITC-葡聚糖水平较低，表明它通过肠道屏障渗透到循环中，而不是适当排泄。

血浆中高水平的FITC-葡聚糖强化了这一发现。尝试此过程时，时机至关重要。荧光读数和样品收集应尽可能接近每只小鼠管饲后一小时和四小时。