Этот метод помогает ответить на вопросы о том, изменяет ли состояние целостность кишечного барьера, или на вопросы о том, может ли потенциальное лечение поддерживать целостность кишечного барьера. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предлагает неинвазивный метод с низкой нагрузкой для оценки и количественной оценки проницаемости кишечника in vivo. Для начала постите мышей в течение четырех часов, затем введите 200 микролитров суспензии FITC-декстрана через ротовой зонд каждой мыши, используя 38-миллиметровую стерилизованную иглу изогнутого зонда 22-го калибра.
Запустите таймер после первого зонда и подождите от пяти до 10 минут между каждым зондом, чтобы обеспечить измерения in vivo, сохраняя один час после зонда. Оставьте оставшуюся подвеску FITC-декстрана для стандартной кривой. Запустите машину и программное обеспечение, нажав и удерживая кнопку запуска, и дайте системе прогреться.
Нажмите «Состояние устройства» и убедитесь, что все настроенные устройства показывают «ОК», прежде чем продолжить. Затем нажмите «Новое исследование» и сохраните файл с нужным именем. Затем нажмите «Параметры обучения».
Введите идентификатор образца, выберите правильный лазер и поэкспериментируйте. Затем удалите мех с области живота с помощью электробритвы и щедро нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Откройте камеру визуализации и поместите животное дорсально на сканирующую пластину.
Затем закрепите конечности и хвост скотчем. Затем выберите область для сканирования с помощью инструмента «Рисование». Убедитесь, что вы включили всю ширину живота от чуть выше печени до прямой кишки.
Затем нажмите на инструмент «Изменить», чтобы настроить область после рисования. Установите разрешение сканирования на 2.0 миллиметра и нажмите «Пуск», чтобы начать сканирование. Затем откройте файлы изображений, найдя их под выбранным именем файла, и одновременно откройте все файлы с синхронизированными настройками.
Используя панель инструментов параметров изображения, используйте кнопки «Синхронизировать изображение» и «Синхронизировать масштаб», чтобы синхронизировать настройки изображения для точного сравнения. Затем сохраните изображения с отрегулированными масштабами. Сравните брюшную флуоресценцию каждого животного и контрольной мыши на равномерно масштабированных изображениях с помощью программного обеспечения, связанного с системой визуализации.
Соберите гранулы фекалий от каждой мыши в стерильную пробирку через четыре часа после зонда. Затем держите трубки на льду и поместите их в темноту. Затем центрифугируют образцы крови при 9 390 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем переложите плазму в новую стерильную пробирку и держите ее на льду в темноте. Разведите 50 миллиграммов образцов фекалий в 200 микролитрах PBS и разбавьте плазму PBS в соотношении один к двум. Пластина 100 микролитровых образцов и стандартов в непрозрачной черной 96-луночной пластине.
Считывание флуоресценции на считывателе флуоресцентных пластин с возбуждением при 485 нанометрах и поглощением при 530 нанометрах. Наконец, определите концентрацию FITC-декстрана на образец, сравнив флуоресценцию с известными концентрациями стандартной кривой. Анализ флуоресценции in vivo показал, что мыши, получавшие только контрольную диету, имели более высокое потребление FITC-декстрана в печени и более высокие уровни остаточной флуоресценции в брюшной полости по сравнению с мышами, получавшими диету с добавлением инулина.
Мыши, получавшие диету с добавлением инулина, имели значительно более низкие уровни FITC-декстрана в плазме по сравнению с мышами, получавшими только контрольную диету. Соответственно, мыши, получавшие инулиновую диету, имели значительно более высокие уровни FITC-декстрана в фекалиях, чем мыши, получавшие только контрольную диету. Более низкие уровни FITC-декстрана в фекалиях контролируемых мышей указывают на то, что он проникал через кишечный барьер в кровоток, а не выводился надлежащим образом.
Высокие уровни FITC-декстрана в плазме подтвердили это открытие. Время имеет важное значение при попытке этой процедуры. Флуоресцентное считывание и сбор образцов должны происходить как можно ближе к одному часу и четырем часам после зонда для каждой отдельной мыши.
