大麻中腺头柄和无柄毛状体的非水分离和富集

该协议的意义在于它在完成协议所需的短时间内具有便利性。这使得柄状毛状体的高通量、高浓度和高度隔离成为可能。这种技术的主要优点是它的简单性。

在该技术中，应考虑植物来源的毛状体密度，并在首次执行协议时通过显微镜检查每一步的分离程度。展示这项技术的将是来自Volcani中心的大麻专家Nurit Shalev。首先使用锤子将干冰块粉碎成小而细的薄片，并在五升的塑料容器中放置一个坚硬的扁平物体。

使用一个大过滤器，将未碎干冰中的细干冰片筛入另一个五升的塑料容器中。将大约 200 立方厘米的干冰片倒入直立的 1 升玻璃烧杯中。在第一层碎干冰上加入多达 10 克冷冻大麻苜蓿花序，并用另外一层 200 立方厘米的细碎干冰覆盖。

然后用两到三层一毫米屏蔽门蚊帐盖住一升玻璃烧杯的开口，并用橡皮筋固定。接下来，将液氮倒入一个大的圆底不锈钢容器中。在面粉筛或筛网过滤器中插入一个 350 微米的网眼，从下方覆盖面粉筛网。

将此面粉筛放在装满液氮的大圆底不锈钢容器上方。为了尽量减少筛分质量的损失，请确保容器的宽度超过面粉筛的宽度。通过摇动一升玻璃杯，其开口朝下指向面粉筛，将毛状体与植物材料分开。

每两到三分钟将烧杯放在一边，以便筛选积聚在面粉筛上的碎干冰和植物材料。水平筛分面粉筛，以方便植物材料进入放置在下方的圆底不锈钢容器中的液氮中。接下来，将液氮添加到不锈钢容器中，将碎碎的干冰添加到一升玻璃烧杯中，当它们的液位不足时。

当面粉筛上的植物材料耗尽时，用另外10克新鲜植物材料重新填充玻璃烧杯中的用过的植物材料，并重复筛分过程，直到在容器中收集足够数量的富集毛状体。在显微镜观察之前，验证浸没在液氮中的不锈钢容器底部是否存在白色粉末状物质，以确认收集足够的毛状体。将少量液氮加入干净的小圆底不锈钢容器中。

然后将具有150微米网孔尺寸的40×40厘米的微筛折叠两次，得到20×20厘米的折叠，并以锥形打开。用一个或两个衣夹将网锥固定在圆底不锈钢容器的边缘，使锥体的打开部分直立，其尖头部分部分浸没在液氮中。完成后，将含有先前获得的白色粉末状物质的液氮轻轻倒入微筛锥中。

使用宽刷子，收集并将第一个容器中剩余的植物材料转移到 150 微米的网状锥体中。接下来，小心地将衣夹从容器的盖子上拆下，打开微筛锥，将毛状体定位在打开的微筛中间。将微筛的所有四个角固定在一起，并将包含毛状体的中间部分浸入液氮中。

轻轻浸入液氮中并摇动微筛一分钟。使用无菌针头，在50毫升试管的盖子上打小孔，以避免压力增加。将包裹在微筛中心的未过筛的植物碎片、干冰和较大的毛状体舀入 50 毫升试管中，并将其储存在零下 80 摄氏度以备将来使用。

通过微筛依次转移浸没在液氮中的过筛毛状体，浇注尺寸从105减小到80到65，然后减少到50微米。每次转移后，分别收集残留在微筛上的不同大小的毛状体，并标记它们。使用无菌针头在管子盖上打小孔。

使用预冷的勺子将浸没在液氮中的所需毛状体转移到50微米的微筛中。然后使用预冷刮刀将粉末状毛状体快速转移到标记的预冷1.5毫升管中，并立即将管子存放在零下80摄氏度以备进一步研究。在分离过程的初始阶段，叶组织碎片在分离部分占主导地位，而最终分离产物完全由未受污染的分离毛状体组成。

在最后的分离步骤中观察了分离出的颗粒状头状茎和无柄毛状体的质量。使用该方法分离的毛状体的纯度与传统方案相当。保留了细腻的柄毛状体头部结构，孤立的柄毛状体的整个头部可见，与传统方法相比，传统方法缺少完整的毛状体头部结构，仅存在椎间盘细胞。

分离毛状体的RNA提取和RNA完整性估计表明RNA完整性数或RIN值从9.4到10，凝胶色谱表明RNA完整性高。仔细地进行150至50微筛分离的T袋状输液运动。这种方法可以深入了解大麻和其他植物物种的毛状体的转录组和可能的蛋白质组组成。

按照这个程序，可以进行代谢和转录组学表征。这些额外的方法可以帮助了解分离毛状体中基因的表达水平及其代谢谱。该技术能够对不同大麻品种的腺毛进行转录组学表征。