我们要感谢美国国立卫生研究院的资金补助R01-AI026328（KAK）和R01-AI079004（KAK）。

1。去除生殖道<ol><li>安乐死鼠标采用批准的指引。低正中切口，并收回皮肤。 </li><li>隔离和删除整个生殖道，由输卵管阴道口。 </li><li>打开整个道纵向剪下来的。 </li><li>良好的手术剪刀切下生殖道细小的碎片（&lt;1毫米左右），一个培养皿完整的RPMI-10/EDTA（见下面的公式），并于125毫升容量瓶中，在室温下搅拌组织在磁力搅拌器上设置15分钟。此过程重复两次，然后将上清液，其中包含上皮细胞和其他碎片，被丢弃。 </li><li>倒入烧瓶的内容，通过细胞过滤器（40微米）。洗掉EDTA的残余物用完全培养基。 完整RPMI/10：：RPMI500毫升（Gibco）中，10％胎儿牛血清（FBS），热灭活，5 ml青霉素/链霉素，5毫升1M HEPES。 完整RPMI-10/EDTA：10％RPMI（定义如上）与5μMÊDTA </li></ol> 2。消化生殖道组织<ol><li>组织片转移到一个新的的烧瓶用20毫升新鲜RPMI-10/collagenase（见下面的配方），并设置为大力搅拌组织在磁力搅拌器上的1小时，在37℃下消化组织。 以完整的RPMI-10/collagenase：用鼠标右键，重组型胶原酶VIII（Sigma公司;储存在-20°C，或根据制造商的说明。），在使用前，添加到完整的RPMI/10终浓度为450-500U/ml。 </li><li>第一消化后，收集上清液，通过100μm的细胞过滤网，将细胞置于冰上保持。 </li><li>未消化的组织转移到新的烧瓶中，并重复执行步骤2.1两次使用的新鲜完全RPMI-10/collagenase为共3个独立的消化。此时，无肉眼可见的组织片应该是在溶液中。 </li><li>池的上清液一起从样本收集到100微米的细胞过滤。旋转的c英语学习生下来。将使用Percoll密度梯度分离细胞沉淀。 </li></ol> 3。使用Percoll密度梯度分离生殖道细胞<ol><li>使用前准备每个浓度的Percoll： <ul><li> 100％等渗Percoll密度：混合9:1股票的Percoll（Pharmacia公司Biot​​ch）与10倍的PBS。 pH值7.4使用HCL。 </li><li> 40％的Percoll溶液：混合40毫升100％等渗Percoll密度和60毫升的完全RPMI中。 </li><li> 70％的Percoll溶液：混合70毫升100％等渗的Percoll用30毫升完全RPMI。 </li></ul></li><li>每个细胞沉淀重悬，从40％的Percoll解决方案中的步骤6。将等体积的70％的Percoll将被用于使梯度。建立梯度管的方法有两种： <ol><li>在层：细胞悬液与40％的Percoll成梯度管，然后小心地根据层70％的Percoll。 </li><li>过层：第一管中加入70％的Percoll，然后小心地慢慢地加载含有上的细胞的40％的Percoll顶部。 </li></ol></li><li>将样品离心梯度@ 900×g离心，室温，20分钟，与制动切断。 </li><li>淋巴细胞，将在40％和70％的Percoll层之间的界面层。小心收获的接口层，洗与RPMI 1:3，在740 XG降速。淋巴细胞的细胞沉淀中，并准备好以供进一步使用。 </li></ol> 4。代表性的成果从小鼠生殖道和流式细胞术（FACS）分析淋巴细胞的隔离的一个例子是在图1中所示。生殖道衣原体muridarum从阴道内感染的小鼠在感染后7天。两个生殖道汇集在一起​​，以便有足够的淋巴细胞的功能和表型检测用流式细胞仪。解剖组织进行处理，正如上文所述的步骤的消化和隔离。单细胞悬浮液染色各种荧光染料共轭对小鼠CD3，CD4和CD8的单克隆抗体。图1示出的CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞对CD3阳性T淋巴细胞门控的点积呈列。我们的程序可以检查不同的疾病模型生殖道分离出的淋巴细胞，在不同的疾病小鼠模型，以评估各种免疫细胞的功能和表型特征。这些包括不同的免疫细胞，如树突状细胞，中性粒细胞，巨噬细胞的NK细胞，NKT细胞，T细胞（抗原特异性的T细胞），B细胞等3-10。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> 图1。淋巴细胞中分离出小鼠的生殖道感染衣原体muridarum的 ，这里介绍的方法使用。后完整的分离过程中，与荧光染料共轭的CD3，CD4和CD8淋巴细胞染色。象限数据选通淋巴细胞CD3 +，显示CD4 +与CD8 +和门控细胞的百分比。

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	<li>M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation.">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , (2010).</li><li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen.">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li><li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+(HSV-2)+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract.">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li><li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue.">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li><li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina.">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li><li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides.">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li><li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection.">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li><li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection.">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li><li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model.">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li><li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract.">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

在这个协议中，它展示了如何准备淋巴细胞小鼠生殖道，很容易掌握。在此过程中最关键的一点是维持细胞活力的保持将细胞置于冰上。从该方法的细胞产量取决于技术，处理技能，鼠标（幼稚或感染后的天）的感染状态，病原体（细菌，病毒，真菌）和部分的小鼠生殖道年审（输卵管，子宫，阴道内段或整个生殖道）。本集团及其他已出版了各种不同的淋巴细胞群的研究小鼠生殖道5-7。</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>西格玛生命科学</td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td>珀</td><td>自GE Healthcare Bio-Sciences公司</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco公司由Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of lymphocytes from mouse genital tract mucosa

粘膜表面，包括胃肠道，泌尿生殖道，呼吸道，进入门户网站的病原体，如病毒和细菌1。粘膜也电感的网站中的一个主机，以产生对病原体的免疫力，如Peyers在肠道中的补丁和在呼吸道的鼻相关的淋巴网状组织。这种独特的功能使黏膜免疫的宿主防御系统的一个重要参与者。许多研究都集中在胃肠道和呼吸道粘膜部位。然而，生殖黏膜部位出现了小调查。生殖道粘膜是性传播疾病（STD），包括细菌和病毒感染的主要感染部位。性传播疾病是当今世界面临的最严重的健康挑战之一。美国疾病控制和预防中心估计，有19万个新的传染病，每年在美国。 STDS成本，美国的医疗保健系统每年的170亿美元的2，个人成本更在近期和终身的健康后果。为了应对这一挑战，需要更深入的了解生殖黏膜免疫和分离淋巴细胞，这些研究是一个必不可少的组成部分。在这里，我们提出了一种方法，再现分离淋巴细胞小鼠女性生殖道的免疫学研究，可以修改为其他物种适应。下面描述的方法是基于在一个鼠标。

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Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

淋巴细胞从小鼠生殖道隔离的一种有效的方式来进行说明。此方法利用酶消化和Percoll梯度分离，以允许有效地隔离。此技术是用于在其他物种中也适应

小鼠生殖道黏膜淋巴细胞分离

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

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Immunology and Infection

14.2K 次观看.  University of California, Los Angeles. 淋巴细胞从小鼠生殖道隔离的一种有效的方式来进行说明。此方法利用酶消化和Percoll梯度分离，以允许有效地隔离。此技术是用于在其他物种中也适应