仪器开发得到了 Grant NSF CHE-1828666 的支持。ZW、JCW 和 WX 由美国国立卫生研究院、美国国立普通医学科学研究所资助，资助 1R35GM138092-01。BY由中国科学院青年创新促进会（CAS，2021183）支持。

1. 高光谱线扫描VSFG显微镜
<ol><li>激光系统<ol><li>使用以 1025 nm ± 5 nm 为中心的脉冲激光系统（参见 材料表）。激光器设置为 40 W、200 kHz（200 μJ/脉冲），脉冲宽度为 ~290 fs。 注意：确切的重复频率可能会有所不同，高重复频率激光通常更适合这种VSFG显微镜。</li>
		<li>将种子激光器的输出引导到商用光学参量放大器 （OPA） 中，以产生中红外 （MIR） 光束（参见 材料表）。将MIR调谐到感兴趣的频率（图1A）。 注：在本研究中，MIR 以 3450 nm ± 85 nm （~2900 ± 72 cm-1） 为中心，脉冲持续时间为 ~290 fs，脉冲能量为 ~6 μJ，包括部分 -CHx 官能团区域。</li>
	</ol></li>
	<li>上转换光束<ol><li>将来自 OPA 的残余 1025 nm 光束通过 Fabry-Perot 标准具（参见 材料表），以产生光谱变窄的上转换光束，其 FWHM 为 ~4.75 cm-1。</li>
		<li>用 8 μm 蓝宝石针孔对狭窄的 1025 nm 光束进行空间滤波。 注意：可以使用近红外卡可视化 1025 nm 光束。</li>
		<li>使用 λ/2 波片控制 1025 nm 脉冲的偏振（参见 材料表）。</li>
	</ol></li>
	<li>MIR光束<ol><li>引导MIR光束通过延迟级，以精细控制时间重叠。</li>
		<li>使用 λ/2 波片控制 MIR 的极化。</li>
	</ol></li>
	<li>VSFG显微镜<ol><li>在定制的二向色镜（DM，图1B）上，上转换光束和MIR光束在空间上重叠，该二向色镜透射到MIR并反射到NIR（参见 材料表）。使用两个虹膜来引导对齐：一个紧跟在 DM 之后，一个在远端。在光圈后使用功率计确定MIR是否居中，并使用NIR卡定位NIR位置。 注意：重叠后，NIR光束可用于引导两个光束。</li>
		<li>将重叠的光束引导到带有集成325 Hz单轴共振光束扫描仪（安装在集成双位置扫描仪（I2PS）上， 图1B）的倒置显微镜中（参见 材料表）。 注意：谐振扫描仪将两条重叠光束的线投射到聚光镜物镜的后孔上。它安装在一个滑块上，可以在 VSFG/SHG 和明场模式之间无缝重新配置。</li>
		<li>用纯反射的史瓦西物镜将两个空间重叠的光束聚焦到样品上（SO，图1B，D）（参见材料表）。</li>
		<li>用无限远校正的折射物镜（RO，图1B，D）收集样品产生的VSFG信号（参见材料表）。</li>
		<li>引导准直输出VSFG信号通过线性偏振器，然后通过由两个f = 60 mm焦距透镜（TL1和TL2，图1B，C）组成的远心镜筒透镜系统（参见材料表）。 注：在单色器的入口狭缝处形成来自镜筒透镜的放大图像（MC，图1B，C），并在二维CCD检测器（CCD，图1B）上检测空间/频率分辨数据。 </li>
	</ol></li>
	<li>SHG 模式<ol><li>要切换到 SHG 成像，请阻挡红外光束并将光谱仪的光栅旋转至 501.5 nm 以对 SHG 信号进行成像。</li>
	</ol></li>
	<li>明场模式<ol><li>要切换到明场光学成像，请打开白光源（参见 材料表）。移动集成滑块（I2PS， 图1B）以在反向传播方向上收集明场图像，成像物镜（RO）作为聚光镜，聚光镜物镜（SO）作为成像物镜。</li>
		<li>使用市售的镜筒透镜系统，在RGB明场相机的传感器平面上形成折射物镜的准直输出图像（参见 材料表）。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig01.jpg"> 图1：多模态高光谱VSFG显微镜。 （一） 核心设置的顶视图。 将 1025 nm 泵浦激光器发送到 OPA 以产生可调谐的中红外脉冲。残余的 1025 nm 经常被标准具 （E） 收窄，并通过空间滤光片 （SFG） 在空间上滤波到高斯光束中。中红外和 1025 nm 光束在定制的二向色镜 （DM） 上空间重叠，并通过倒置显微镜（ A 中的盒形区域）引导。（B） 将两束光束发送到安装在集成 2 位滑块 （I2PS） 上的 325 Hz 谐振光束扫描仪，从而实现明场和非线性光学模式之间的无缝切换。显微镜平台配备了一个基于反射的无限远校正史瓦西物镜（SO）作为聚光镜，以及一个基于折射的无限远校正成像物镜（RO），安装在垂直纳米定位（VNP）z轴载物台上。SO 聚焦谐振光束扫描仪反射到样品上的入射光束线，而 RO 收集信号的 VSFG 线段。重要的是以 1 μm 的精度精细控制 RO 的 z 轴位置，以确保样品处于高质量成像的最佳焦点条件。然后，VSFG信号的准直线被引导到由2个桶状透镜（TL1和TL2）组成的镜筒透镜系统，在单色器（MC）的入口狭缝处形成放大图像。然后，在电荷耦合器件（CCD）上对频率分辨谱线进行高光谱成像。收集每条高光谱线后，使用NP在垂直于共振束扫描仪扫描轴的轴上扫描样品。为了收集样品的明场图像，将I2PS移动到明场位置，并安装一个拦截白光源（WLS）的镜子。然后，光由RO聚焦，并由SO成像。然后在倒置显微镜顶部的明场相机（BC）的传感器平面上形成图像。（C） 通过镜筒透镜区域进入 MC 和 CCD 的光路的详细视图。（D） SO和RO之间的样品区域的详细视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
2. 高光谱显微镜对准和垂直CCD轴空间校准
<ol><li>使用ZnO（1μm厚）图案溅射镀膜的标准样品15 mm x 15 mm x 0.170 mm±0.005 mm盖玻片粗略优化样品平面（纳米定位器z轴）的位置，并使用明场成像模式将其置于明场焦点。 注意： RO 的 z 位置以及白光的对齐可能需要根据需要进行调整。用于对准校准的玻璃图案上ZnO的代表性图像如图 2所示。</li>
	<li>将 I2PS 移回非线性照明臂，并优化样品高度，以获得在 CCD 相机上观察到的 ZnO 区域产生的最大非共振 VSFG 强度。 注意： 必须调整 RO 的 z 位置以获得最大强度。在达到样品的最佳高度和RO之前，可能需要迭代步骤2.1和2.2几次。</li>
	<li>打开共振光束扫描仪并收集一行图像。</li>
	<li>通过垂直于光束扫描仪方向扫描样品来收集非共振强度图像。对图像数据进行垂直切片并建立像素：微米比。（请参阅图 3 及其图 例）。 注：分析这些线截面的导数，以产生垂直CCD轴像素：微米比，该比将用于未来的图像。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig02.jpg"> 图 2：ZnO 图案明场成像模式粗略对齐的代表性图像质量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig03.jpg"> 图 3：垂直轴校准工作流程。 该图说明了如何以μm为单位将CCD像素转换为垂直空间尺寸。 （A）收集并重建ZnO图案盖玻片的图像。然后，从图案的一个边缘到另一个边缘的像素距离（ A 中的小垂直条）。由于 ZnO 图案交叉设计为具有 25 μm 的宽度，因此可以使用此处的物理宽度与像素宽度的比率来计算物理/像素尺寸比。（B）中显示了具有代表性的垂直轴校准图像。 （C） 最后，按照红线所示进行垂直切片。（D）取垂直切片的导数得到空间分辨率。使用垂直切片的导数来获得空间分辨率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
3. 高光谱数据采集
<ol><li>在CCD上收集VSFG信号垂直线的光谱，其光谱沿水平轴分散，空间位置记录在CCD的垂直轴上。 注意：这将生成单行截面的二维数据集。</li>
	<li>在对样品的线截面进行高光谱成像后，使用三维纳米定位器在垂直于线扫描轴的轴上扫描样品（NP， 图1）。 注意：3D 纳米定位器对于定位样品区域（x-y 平面）以及使样品聚焦（z 轴）的高精度和可重复性非常重要。</li>
	<li>在步骤 3.1 和步骤 3.2 之间迭代以收集 VSFG 高光谱图像。</li>
</ol>4. 高光谱数据分析
<ol><li>使用MatLab成像工具箱的高光谱成像库工作流程41对数据进行光谱解混。 注：光谱分离将空间位置与独特的光谱相关联。用于高光谱数据分析的 Matlab 代码在 补充文件 1 中提供。<ol><li>使用 Matlab 图像处理工具箱高光谱成像库41 中的超立方体函数创建 4 维超立方体（x = 空间，y = 空间，z = 频率相关强度，ω = 频率）。</li>
		<li>使用 countEndmembersHFC 函数识别唯一光谱的数量，误报概率 （PFA） 值为 10-7。</li>
		<li>使用 nfindr 光谱解混功能识别独特的光谱。</li>
		<li>最后，使用 sid 函数，将每个像素与上一步中标识的唯一光谱之一相关联。 注：可以使用 MatLab 高光谱成像库41 中提供的替代函数/算法来完成其他光谱分离和匹配方法。</li>
	</ol></li>
	<li>将每个孤立工作表的总和数据拟合到 Voigt 函数42（补充文件 1）。 注：洛伦兹函数表示纯齐次线形极限，而高斯函数源自非齐次极限。实际上，这些系统可能处于均匀和非均匀极限的组合中，这需要Voigt函数 - 凝聚相光谱的常见做法，包括VSFG。</li>
</ol>5. 样品的几何分析
<ol><li>按照步骤 5.2-5.3 中提到的步骤确定样品的几何形状。本研究以SDS@2 β-CD为例。根据 SDS@2 β-CD 介观片样品分子亚基的 C7 对称性，推导 χ（2） 的对称性允许张量元素。 注：χ（2） 允许的对称性取决于对称性。要计算任何对称性的允许非线性磁化率，请参阅参考文献43。</li>
	<li>应用欧拉旋转27 将实验室框架测量值与分子框架相关联。 注：在 SDS@2 β-CD 的情况下，其 C7 对称性导致 8 个独立方程，将 8 个输出（实验室坐标系 χ（2））与 8 个输入（6 个独立的超极化率 β（2））和两个角度：Θ，相对于所有片材样品平面的倾斜角，以及 φ，片材的面内旋转（图 4））。两张纸用于提取两张纸的共同分子排列。可以从明场图像中提取φ1 和 φ2（两片的平面内旋转角度）之间的关系。在当前示例中，φ2 = φ1 + 60°。假设所有分子单位都以相同的角度平铺，因此 Θ1 = Θ2。这导致了 11 个未知数（9 个独立的未知数，包括 6 个独立的超极化率 β（2），Θ 1 和 φ1，以及 16 个已知（每张 8 个实验室框架极化和 2 个）的 N 片和两个相关角（φ 2 和 Θ2）之间的相对覆盖率）。</li>
	<li>将偏振分辨实验室坐标系χ（2）和分子坐标系超极化率β（2）与神经网络函数求解器相关联。 注：此方法的详细摘要可在参考文献27 中找到。<ol><li>在 Python44中使用由 200-100-50 节点结构和双曲切线激活函数组成的 Keras 创建分层神经网络模型。</li>
		<li>创建一个随机生成的 100000 x 11 矩阵，其中包含 β（2）、Θ1、Θ 2、φ1、φ2 和 N 的值。</li>
		<li>使用计算出的 χ（2） 值（总共 100,000 x 16 个值）作为输入，并学习在提供 16 个 χ（2） 值时预测 11 个值（β（2）、Θ1、Θ 2、φ1、φ 2 和 N）。</li>
		<li>训练后，使用另一组 1000 个条目（输入和输出）来测试训练的模型。预测输出和真实输出应显示斜率为 1 的线性关系。</li>
		<li>最后，从两张纸中提供实验测量的χ（2）（ 每张纸有8个χ（2） 测量），并使用训练好的模型来预测倾斜角Θ以及其他属性。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig04.jpg"> 图 4：欧拉变换示意图。 （A） 实验室坐标（XYZ）二级磁化率χ（2）和分子坐标（xyz）超极化率（βijk）之间的欧拉变换示意图。z-y'-z'' 欧拉旋转是在分子坐标上进行的，其中 φ 为面内旋转角，θ 为倾斜角，ψ 为扭转角。ψ被积分出来，用于围绕分子轴的任意扭转角。φ没有被整合出来，因为所有分子都相对于实验室框架旋转到特定角度以形成自组装的薄片。N是两张纸的相对表面覆盖率。（B）由神经网络结果确定的形成薄片的倾斜亚基的可视化。该数字已根据 Wagner 等人 27 修改而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

使用 VSFG 显微镜进行多模式、快速、高光谱化学分析

作者没有什么可透露的。

最关键的步骤是从 1.42 到 1.44。为了获得光学空间分辨率，必须很好地对准物镜。收集发射信号、中继并将扫描光束投射为入口狭缝处的一条线也很重要。正确的对齐将保证最佳的分辨率和信噪比。对于典型的样品，如 SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm 片材，具有高信噪比的高分辨率图像（~1 μm 分辨率）需要 20 分钟。这已经比以前版本的仪器24,26 更快。通过更高...

振动和频生成 （VSFG） 是一种二阶非线性光学技术1,2，已被广泛用作光谱学工具，以化学分析允许对称性的样品 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13， 14,15,16,17,18,19,20,21,22。传统上，VSFG已应用于界面体系8,9,10,11（即气-液、液-液、气-固、固-液），这些体系缺乏反转对称性 - 这是VSFG活性的要求。VSFG的这一应用提供了埋藏界面12,13，界面14,15,16,17,18处水分子的构型以及界面19,20,21,22处化学物质的丰富分子细节。
尽管VSFG在确定界面处的分子种类和构型方面具有很强的实力，但其在测量缺乏反转中心的材料的分子结构方面的潜力尚未得到发挥。这在一定程度上是因为材料的化学环境、成分和几何排列可能具有不同质性，而传统的 VSFG 光谱仪具有大约 100 μm2 的大照明区域。因此，传统的VSFG光谱法报告了样品在典型的100 μm2照明区域内的集合平均信息。这种集成平均可能导致具有相反方向的有序域之间的信号抵消和对局部异质性的错误表征 15,20,23,24。
随着高数值孔径 （NA） 和基于反射的显微镜物镜（Schwarzschild 和 Cassegrain 几何形状）的进步，它们几乎没有色差，VSFG 实验中两个光束的焦点尺寸可以从 100 μm 2 减小到 1-2 μm2，在某些情况下可以减小亚微米25。包括这项技术进步在内，我们小组和其他公司已将VSFG开发成显微镜平台20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。最近，我们实现了一种倒置光学布局和宽带检测方案37，该方案可以无缝收集多模态图像（VSFG、二次谐波产生（SHG）和明场光学）。多模态成像允许使用光学成像快速检查样品，将各种类型的图像关联在一起，并在样品图像上定位信号位置。通过消色差照明光学器件和脉冲激光照明源的选择，该光学平台允许未来无缝集成其他技术，例如荧光显微镜38 和拉曼显微镜等。
在这种新的安排中，已经研究了分层组织和一类分子自组装（MSA）等样本。这些材料包括胶原蛋白和仿生学，其中化学成分和几何组织对材料的最终功能都很重要。由于VSFG是二阶非线性光信号，因此它对分子间排列39,40特别敏感，例如分子间距离或扭曲角，使其成为揭示化学成分和分子排列的理想工具。这项工作描述了核心仪器的 VSFG、SHG 和明场模式，该仪器由泵浦光学参量放大器 （OPA） 的掺镱腔固体激光器、自制的多模态倒置显微镜和耦合到二维电荷耦合器件 （CCD） 探测器的单色器频率分析仪27 组成。提供了分步的构造和对齐程序，以及完整的设置部件列表。本文还以MSA为例，对MSA进行了深入分析，MSA的基本分子亚基由一个分子十二烷基硫酸钠（SDS）（一种常见的表面活性剂）和两个分子的β-环糊精（β-CD）（本文称为SDS@2 β-CD）组成，以说明VSFG如何揭示有组织物质的分子特异性几何细节。还已经证明，MSA的化学特定几何细节可以使用神经网络函数求解器方法确定。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Camera Por</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA4100</td>
			<td>connect a camera to a microscope or optical system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MRA25-M01</td>
			<td>reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221; Universal Post Holder-5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>UPH3-P5</td>
			<td>hold and support posts of various sizes and configurations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP4S</td>
			<td>convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CEA1500</td>
			<td>provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Cage Mounted &#216;50.0 mm Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP50S</td>
			<td>control the amount of light passing through an optical system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Cage Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP01B</td>
			<td>mount and position a 60 mm cage system in optical setups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air spaced Etalon</td>
			<td>SLS Optics Ltd.</td>
			<td>Customized</td>
			<td>generate narrow-band 1030 nm light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Plate Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>Newton&#160;</td>
			<td>2D CCD for frequency and spatial resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collinear Optical Parametric Amplifier</td>
			<td>Light Conversion</td>
			<td>Orpheus-One-HP</td>
			<td>Tunable MID light generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Chloride</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A16064.30</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized Dichroic Mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Customized</td>
			<td>selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ext to M32 Int Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A34</td>
			<td>provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity Corrected Refractive Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420150-9900-000</td>
			<td>Refractive Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity Corrected Schwarzschild Objective</td>
			<td>Pike Technologies Inc.</td>
			<td>891-0007</td>
			<td>Reflective objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Carbide, Light-Conversion</td>
			<td>C18212</td>
			<td>Laser source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32x0.75 External to Internal RMS</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M32RMSS</td>
			<td>adapt or convert the threading size or type of microscope objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M32M27S</td>
			<td>adapt or convert the threading size or type of microscope objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mid-Height Condenser Focus Module</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ZFM1030</td>
			<td>adjust the focus of an optical element</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>Shamrock 500i</td>
			<td>Provides frequency resolution for each line scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized module with 1&#34; Travel for Edge-Mounted Arms</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ZFM2020</td>
			<td>control the vertical positon of the imaging objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioner</td>
			<td>Mad City Labs Inc.</td>
			<td>MMP3</td>
			<td>3D sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant Scanner</td>
			<td>EOPC</td>
			<td>SC-25</td>
			<td>325Hz resonant beam scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGB Color CCD Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCU224C</td>
			<td>Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGB tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ITL200</td>
			<td>white light collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>OPX2400</td>
			<td>incorporate a sliding mechanism with two fixed positions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB1</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSA2100</td>
			<td>securely mount and position condensers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C60L24</td>
			<td>enclose and protect the components inside the cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>J63394.AK</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1&#34; Cerna Travel Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCM3001</td>
			<td>control ZFM2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1380-AB - N-BK7</td>
			<td>SFG signal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visible LED Set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA1010</td>
			<td>provide illumination in imaging setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitelight Source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA1010</td>
			<td>Whitelight illumination source for brightfield imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPH05M-1030 - &#216;1/2&#34; Zero-Order Half-Wave Plate, &#216;1&#34; Mount, 1030 nm&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH05M-1030</td>
			<td>alter the polarization state of light passing through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPLQ05M-3500 - &#216;1/2&#34; Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 &#181;m&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPLQ05M-3500</td>
			<td>alter the polarization state of light passing through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages</td>
			<td>Optosigma</td>
			<td>TSD-65122CUU</td>
			<td>positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XT95 4in Rail Carrier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XT95RC4</td>
			<td>mount and position optical components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XYR1</td>
			<td>precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(1/2&#34;) Linear Translator with Central SM1 Thru Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XYT1</td>
			<td>provide precise movement and positioning in two dimensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yb doped Solid State Laser</td>
			<td>Light Conversion</td>
			<td>CB3-40W</td>
			<td>Seed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>J63161.22</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal nonlinear hyperspectral chemical imaging using line-scanning vibrational sum-frequency generation microscopy

振动和频生成 （VSFG） 是一种二阶非线性光信号，传统上作为一种空间分辨率为 ~100 μm 的光谱技术用于研究界面处的分子。然而，光谱学对样品的异质性不敏感。为了研究介观异质样品，我们与其他人一起将VSFG光谱的分辨率极限降低到~1μm水平，并构建了VSFG显微镜。这种成像技术不仅可以通过成像解析样品形态，还可以在图像的每个像素点上记录宽带VSFG光谱。作为一种二阶非线性光学技术，其选择规则能够可视化生物学、材料科学和生物工程等中常见的非中心对称或手性自组装结构。在本文中，将引导观众了解一种倒置透射设计，该设计允许对未固定的样本进行成像。这项工作还表明，VSFG显微镜可以通过将其与神经网络函数求解器相结合来解析单个自组装板材的化学特定几何信息。最后，对不同样品在明场、SHG和VSFG构型下获得的图像进行了简要讨论，讨论了VSFG成像所揭示的独特信息。

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical technique1,2, has been used extensively as a spectroscopy tool to chemically profile symmetry-allowed samples3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionally, VSFG has been applied to interfacial systems8,9,10,11 (i.e., gas-liquid, liquid-liquid, gas-solid, solid-liquid), which lack inversion symmetry - a requirement for VSFG activity. This application of VSFG has provided a wealth of molecular details of buried interfaces12,13, configurations of water molecules at interfaces14,15,16,17,18, and chemical species at interfaces19,20,21,22.
Although VSFG has been powerful in determining molecular species and configurations at interfaces, its potential in measuring molecular structures of materials lacking inversion centers has not been fulfilled. This is partly because the materials could be heterogeneous in their chemical environment, compositions, and geometric arrangement, and a traditional VSFG spectrometer has a large illumination area on the order of 100 &#181;m2. Thus, traditional VSFG spectroscopy reports on ensemble-averaged information of the sample over a typical 100 &#181;m2 illumination area. This ensemble averaging may lead to signal cancellations between well-ordered domains with opposite orientations and mischaracterization of local heterogeneities15,20,23,24.
With advances in high numerical aperture (NA), reflective-based microscope objectives (Schwarzschild and Cassegrain geometries), which are nearly free of chromatic aberrations, the focus size of the two beams in VSFG experiments can be decreased from 100 &#181;m2 to 1-2 &#181;m2 and in some cases submicron25. Including this technological advancement, our group and others have developed VSFG into a microscopy platform20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recently, we have implemented an inverted optical layout and broadband detection scheme37, which enables a seamless collection of multimodal images (VSFG, second harmonic generation (SHG), and brightfield optical). The multi-modality imaging allows quick inspection of samples using optical imaging, correlating various types of images together, and locating signal positions on the sample images. With the achromatic illumination optics and choice of pulsed laser illumination source, this optical platform allows for future seamless integration of additional techniques such as Fluorescence microscopy38 and Raman microscopy, among others.
In this new arrangement, samples such as hierarchical organizations and a class of molecular self-assemblies (MSAs) have been studied. These materials include collagen and biomimetics, where both the chemical composition and geometric organization are important to the ultimate function of the material. Because VSFG is a second-order nonlinear optical signal, it is specifically sensitive to intermolecular arrangements39,40, such as intermolecular distance or twisting angles, making it an ideal tool for revealing both chemical compositions and molecular arrangements. This work describes the VSFG, SHG, and brightfield modalities of the core instrument consisting of a ytterbium-doped cavity solid-state laser that pumps an optical parametric amplifier (OPA), a home-built multimodal inverted microscope and monochromator frequency analyzer coupled to a two-dimensional charged coupled device (CCD) detector27. A step-by-step construction and alignment procedures, and a complete part list of the setup, are provided. An in-depth analysis of an MSA, whose fundamental molecular subunit is comprised of one molecule of sodium-dodecyl sulfate (SDS), a common surfactant, and two molecules of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD), known as SDS@2&#946;-CD herein, are also provided as an example to show how VSFG can reveal molecule-specific geometric details of organized matter. It has also been demonstrated that chemical-specific geometric details of the MSA can be determined with a neural network function solver approach.

作者聚焦：揭示 VSFG 显微镜在研究介观异质自组装结构中的潜力 

基于线扫描振动和频生成显微镜的多模态非线性高光谱化学成像

We aim to study mesoscopically heterogeneous self-assembled samples, such as biological tissues, to reveal their chemical composition and molecular arrangements. We are exploring how the microscopic arrangement and mesoscopic morphology of these self materials relate to their microscopic properties. With advances in high numerical aperture and reflective-based microscope objectives, we as well as others have demonstrated vibrational sum-frequency generation microscope with one square micron resolution, which can simultaneously record images of soft materials and also spatially resolve the spectral, forming the so-called hyperspectral images.Hyperspectral imaging records experimental data in multiple dimensions, two in spaces, one in frequency and possibly one in time. However, quick collection, storage, and analysis of such big data to maximize information remains a challenge. Sampling the image only to collect useful data points is also challenging.By developing a faster line-scanning technology, we could accelerate the data acquisition time by 100-fold. Furthermore, the microscope is compatible with sum-frequency generation or SFG, second harmonic generation or SHG, as well as broad-field imaging. Multimodality imaging allows quick inspection of samples using optical imaging and correlating various image modalities.SHG imaging assists the optical technique of our technique, but without the spectral resolving power, is widely used in biophysics. Our SFG microscope will now be able to provide powerful molecular level insights currently missing in biophysical studies of soft tissues.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig05.jpg"> 图5：SDS@β-CD的分子结构、形貌和电位取向 。 （A） SDS@β-CD的俯视图和（B）侧视图化学结构。（C）样品平面上介尺度片片的代表性异质样品分布。分子亚基在底物上可能具有不同的取向和排列，这是未知的。该数字已根据 Wagner ...

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开发了一种多模态快速高光谱成像框架，用于获取宽带振动和频生成（VSFG）图像以及明场二次谐波生成（SHG）成像模式。由于红外频率与分子振动共振，揭示了对称性允许样品的微观结构和介观形态学知识。

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a ...

我们的目标是研究介观异质自组装样品，例如生物组织，以揭示其化学成分和分子排列。我们正在探索这些自材料的微观排列和介观形态如何与它们的微观特性相关。随着高数值孔径和反射式显微镜物镜的进步，我们和其他人已经展示了分辨率为1平方微米的振动和频生成显微镜，它可以同时记录软材料的图像，还可以在空间上分辨光谱，形成所谓的高光谱图像。高光谱成像在多个维度上记录实验数据，两个在空间中，一个在频率上，可能在一个时间上。然而，快速收集、存储和分析此类大数据以最大限度地利用信息仍然是一个挑战。仅对图像进行采样以收集有用的数据点也具有挑战性。通过开发更快的线扫描技术，我们可以将数据采集时间缩短 100 倍。此外，该显微镜还兼容和频产生（SFG）、二次谐波产生（SHG）以及宽视场成像。多模态成像允许使用光学成像和关联各种图像模态对样品进行快速检测。SHG成像辅助光学技术，但缺乏光谱分辨能力，在生物物理学中应用广泛。我们的SFG显微镜现在将能够提供目前在软组织生物物理研究中缺失的强大的分子水平见解。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

902 次观看.  UC San Diego. 我们的目标是研究介观异质自组装样品，例如生物组织，以揭示其化学成分和分子排列。我们正在探索这些自材料的微观排列和介观形态如何与它们的微观特性相关。随着高数值孔径和反射式显微镜物镜的进步，我们和其他人已经展示了分辨率为1平方微米的振动和频生成显微镜，它可以同时记录软材料的图像，还可以在空间上分辨光谱，形成所谓的高光谱图像。高光谱...