基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成

该协议的总体目标是将细胞聚集并包裹在半固体基质中。然后，包埋的细胞聚集体可用于下游的三维体外培养，或作为体内移植实验的载体。该方法的主要优点是它使用简单的方法和设备来实现细胞聚集。

它也可以应用于一系列细胞类型和数量。该技术揭示了脾脏再生所需的特定细胞类型。它可以揭示脾脏组织再生的进一步调节因子，或作为更广泛的组织工程研究的平台。

首先在零下 20 摄氏度的冰箱内预冷 200 微升移液器吸头盒。然后将封口膜浸入 80% 乙醇中 10 分钟，然后在 PBS 中洗涤 10 分钟。要制备细胞溶液，将所需的细胞数量等分到14毫升锥形管中。

将细胞在200g和4摄氏度下离心5分钟。然后小心地吸出上清液，留下大约 20 微升的体积。然后可以将细胞沉淀重悬于剩余的上清液体积中。

使用预冷的移液器吸头，吸出 2 微升冰冷的 Matrigel。轻轻扭转并弹出以取出移液器吸头。拉伸预先灭菌的封口膜条，并将其放在移液器吸头的末端，注意不要刺穿薄膜。

继续将封口膜缠绕在侧面以确保尖端密封。然后将细胞溶液轻轻地铺在基质胶上。将移液器吸头放在冰上，准备一个 14 毫升的锥形管，里面放着一个 1.2 毫升的簇状管。

然后可以将移液器吸头插入嵌套管配置中，并在 400 克和 4 摄氏度下离心 5 分钟。将试管在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。管子可以放在冰上，直到进一步需要。

小心地从移液器吸头上取下石蜡膜，然后插入细丝柱塞，并将基质胶塞排出到组织培养基中。聚集的细胞可以在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养。使用电动剪刀剃毛，并用 80% 乙醇擦拭皮肤。

在垂直于脊柱的皮肤上做一个两厘米的切口，并暴露腹膜壁。然后在肾脏上方的腹膜壁上做第二个较小的切口。施加压力并使肾脏外部化。

通过定期使用无菌 PBS 确保肾脏保持湿润。用一把超细镊子捏住肾囊，然后用第二把镊子向相反的方向轻轻撕开。小心地将包膜与肾实质分开。

用一把镊子提起肾囊，然后慢慢地将移液器吸头滑过开口。轻轻地将金属丝柱塞插入移液器吸头，然后排出基质胶塞。用PBS润湿肾脏并重新内化到腹膜腔中。

用 5-O-Vicryl 缝合线缝合腹膜壁，并使用 AutoClip 涂抹器和两个 9 毫米伤口夹闭合皮肤切口。该协议的一个关键步骤是在半固体基质中聚集细胞。中间层定位是通过最佳离心速度实现的。

较高的速度将细胞推到移液器的最尖端，而速度不足会阻止细胞在基质中移动。凝固后，基质胶结构可以从移液器吸头中弹出。体外培养的脾基质结构形成三维球形类器官结构。

类器官显示非空心结构，细胞存在于组织的整个直径上。它们由三大细胞群组成，包括白细胞、红细胞和非造血基质细胞和内皮细胞。构建体也可以移植到肾囊下进行组织再生研究。

4周后，可观察到有组织的脾脏组织结构，包括中央小动脉、B细胞滤泡、成纤维细胞网状细胞、红髓髓细胞、边缘区嗜金属巨噬细胞、红浆窦状细胞、滤泡树突状细胞网络、T细胞区、红浆巨噬细胞和边缘区网状细胞。在尝试细胞聚集和封装时，重要的是要记住要快速工作并将所有材料保持在冰上。移植最重要的步骤是排出基质胶塞，同时从肾脏中取出移液器尖端。

必须注意不要穿孔包膜或破坏肾实质。该方案用于研究脾脏组织再生中对两个基质细胞群的要求。在这个具有代表性的实验中，只有血小板衍生的生长因子受体-β阳性MAdCAM阴性细胞的聚集体未能启动组织生长，这表明这种特殊的细胞群对于脾脏再生至关重要。