El objetivo general de este protocolo es agregar y encerrar células dentro de una matriz semisólida. Los agregados celulares incrustados se pueden utilizar aguas abajo en cultivos in vitro tridimensionales o como vehículo para experimentos de trasplante in vivo. La principal ventaja de este método es que utiliza una metodología y un equipo sencillos para lograr la agregación celular.
También se puede aplicar a una variedad de tipos y números de celdas. Esta técnica ha revelado un tipo específico de célula que se requiere para que el bazo se regenere. Podría descubrir más reguladores de la regeneración del tejido del bazo o servir como plataforma para estudios más amplios de ingeniería de tejidos.
Comience enfriando previamente una caja de puntas de pipeta de 200 microlitros dentro de un congelador a menos 20 grados centígrados. A continuación, sumerja Parafilm en etanol al 80% durante 10 minutos, seguido de un lavado de 10 minutos en PBS. Para preparar la solución celular, alícuota el número de célula deseado en un tubo cónico de 14 mililitros.
Centrifugar las células a 200 g y 4 grados centígrados durante 5 minutos. A continuación, aspire con cuidado el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 20 microlitros de volumen. A continuación, el gránulo de la célula puede resuspenderse en el volumen sobrenadante restante.
Con una punta de pipeta preenfriada, aspire 2 microlitros de Matrigel helado. Gire suavemente y expulse para retirar la punta de la pipeta. Estire una tira preesterilizada de Parafilm y colóquela sobre el extremo de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no perforar la película.
Continúe envolviendo el Parafilm alrededor del costado para asegurarse de que la punta esté sellada. A continuación, coloque la solución celular suavemente sobre el Matrigel. Deje la punta de la pipeta en hielo y prepare un tubo cónico de 14 mililitros con un tubo de racimo de 1,2 mililitros colocado en su interior.
A continuación, la punta de la pipeta puede insertarse dentro de la configuración del tubo anidado y centrifugarse a 400 g y 4 grados centígrados durante 5 minutos. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 15 minutos. El tubo se puede colocar en hielo hasta que se requiera más.
Retire con cuidado el Parafilm de la punta de la pipeta, luego inserte un émbolo de alambre delgado y expulse el tapón Matrigel al medio de cultivo de tejidos. Las células agregadas se pueden cultivar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Afeita el pelaje con una maquinilla eléctrica y frota la piel con etanol al 80%.
Hacer una incisión de dos centímetros en la piel perpendicular a la columna vertebral y exponer la pared peritoneal. Luego se hace una segunda incisión más pequeña en la pared peritoneal por encima del riñón. Aplicar presión y exteriorizar el riñón.
Asegúrese de que el riñón se mantenga húmedo mediante la aplicación regular de PBS estéril. Pellizque la cápsula del riñón con un par de pinzas ultrafinas y, con un segundo par, rasgue suavemente en direcciones opuestas. Separe cuidadosamente la membrana de la cápsula del parénquima renal.
Levante la cápsula de riñón con un par de pinzas y deslice lentamente la punta de la pipeta a través de la abertura. Inserte suavemente un émbolo de alambre en la punta de la pipeta y expulse el tapón Matrigel. Humedecer el riñón con PBS y volver a internalizarlo en la cavidad peritoneal.
Cierre la pared peritoneal con suturas 5-O-Vicryl y cierre la incisión cutánea con un aplicador AutoClip y dos pinzas para heridas de 9 milímetros. Un paso clave en este protocolo es la agregación de células dentro de una matriz semisólida. El posicionamiento de la capa intermedia se logra a través de velocidades de centrifugación óptimas.
Las velocidades más altas impulsan las células hasta la punta de la pipeta, mientras que las velocidades insuficientes impiden el movimiento de las células a través de la matriz. Después de la solidificación, la construcción Matrigel puede ser expulsada de la punta de la pipeta. Las construcciones estromales del bazo que se cultivan in vitro forman estructuras organoides esféricas tridimensionales.
Los organoides muestran una estructura no hueca con células presentes en todo el diámetro del tejido. Están compuestas por tres amplias poblaciones celulares, que incluyen glóbulos blancos, glóbulos rojos y células estromales y endoteliales no hemopoyéticas. Los constructos también se pueden trasplantar debajo de la cápsula renal para estudios de regeneración de tejidos.
Después de cuatro semanas, se puede observar la estructura organizada del tejido del bazo, que incluye arteriolas centrales, folículos de células B, células reticulares fibroblásticas, células mieloides de pulpa roja, macrófagos metalófilos de la zona marginal, sinusoides de pulpa roja y redes de células dendríticas foliculares, zona de células T, macrófagos de pulpa roja y células reticulares de la zona marginal. Al intentar la agregación y encapsulación celular, es importante recordar trabajar rápidamente y mantener todos los materiales en hielo. El paso más importante para los trasplantes es expulsar el tapón Matrigel mientras se retira la punta de la pipeta del riñón.
Se debe tener cuidado de no perforar la membrana de la cápsula ni de romper el parénquima renal. Este protocolo se utilizó para investigar los requisitos de dos poblaciones de células estromales en la regeneración del tejido del bazo. En este experimento representativo, solo los agregados agotados de células MAdCAM positivas para el receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas no lograron iniciar el crecimiento del tejido, lo que sugiere que esta población celular en particular es esencial para que el bazo se regenere.
