我们感谢许多以前的实验室成员和湾区基因组编辑社区为这些方法的发展做出的贡献。我们感谢罗斯. 威尔逊批判地阅读了这篇手稿。
亚历山大马森的研究得到了来自杰克 Aronov 和全国多发性硬化社会补助金 (CA 1074-21) 的礼物的支持。亚历山大马森为来自斯勒威威威基金的医学科学家颁发了职业奖, 是一位 Biohub 调查员。雅各布玉米的研究得到了李嘉诚基金会、遗产医学研究医学院和加利福尼亚再生医学研究所的支持。Behnom Farboud 和芭芭拉 j. 迈耶的研究部分是由研究院补助金 R01 GM030702 给芭芭拉 j. 迈耶, 他是霍华德休斯医学研究所的调查员。艾琳. 贾维斯和 Nipam h. 帕特尔的研究部分由 nsf 资助 IOS-1257379 和艾琳. 贾维斯承认来自 nsf GRFP 和 Philomathia 研究生奖学金的支持。

作者亚历山大马森和雅各布 e 玉米是聚光灯疗法的共同创始人。雅各布玉米是特派团治疗的顾问, 他的实验室得到了阿斯利康和辉瑞赞助的研究支持。亚历山大马森是朱诺疗法和契约疗法的顾问, 他的实验室获得了来自朱诺疗法、Epinomics 和赛诺菲的赞助研究支持。他的实验室也申请了与 Cas9 RNP 技术有关的专利。

在细胞系或感兴趣的生物体中建立一个健壮的基因组编辑协议, 需要对这一节中讨论的几个关键参数进行优化和经验测试。对这里提出的一般方法有一些不同的尝试是非常鼓励的。该协议的主要局限性是, 将这些方法应用于其他细胞或生物体可能会导致不同的结果, 这取决于所研究的物种, 而导致高效基因敲除的实验设计可能不会促进 DNA 的插入。因此, 我们建议从此处介绍的方法开始, 并按照下面的说明进行故障排除。
基因组编辑试剂质量疑难解答: 生成或购买高质量的试剂是任何基因组编辑协议的关键步骤。Cas9 蛋白可以在实验室纯化或商业化购买。许多协议注意到 Cas9 在 RNP 食谱中的最终浓度, 但最佳的基因编辑活动将取决于任何个体 Cas9 蛋白制剂的特定活动, 这取决于来源的不同。一旦在这里提出的协议是工作, 考虑优化 RNP 使用的数量滴定 Cas9 水平, 以建立一个最佳浓度: 一个提供高度特异的目标 DNA 裂解, 而不必要的离靶分裂造成的过度 Cas940。
指南 RNA 纯度和同质性也可以是基因组编辑成功的决定因素22。购买的 sgRNAs 或单独的 crRNA 和 tracrRNA 组件通常是高质量的试剂, 并且有多种化学修饰可用于消除 RNA 降解的问题或将附加功能灌输给 RNP91。虽然化学修饰的 gRNAs 可能不是标准基因组编辑实验所必需的, 但有些组观察到了更高的编辑效率与这种试剂, 所以他们可能值得尝试后, 掌握的过程和/或当 gRNA 降解似乎是一个问题22,91。体外转录和随后的凝胶纯化是一种廉价的替代品, 它可能足以用于常规基因组编辑实验17,21,49,50。此外, 通常适用于产生同质 gRNA 种群在体内的几种方法, 包括核酶和基于 tRNA 的单个参考线的切除, 可扩展到体外RNA 制备, 以生成清洁剂。产品92。
指南 RNA 和捐赠者 DNA 设计提示: 引导 RNA 的选择是实现高效的目标编辑的关键因素, 同时最大限度地减少了离靶解的几率。为了帮助引导选择, 一些研究使用高通量屏幕加上下一代排序, 以编译成功的参考线47,79,93,94的序列特征, 95,96。这些功能已用于开发预测算法和在线工具, 以帮助引导选择44,45,46,47,48。这种算法是基于基于 DNA 的制导 RNA 表达系统的屏幕上进行的。指南是使用一个三级启动子表示的, 因此它们的表达式很容易与第三级转录相关的限制, 例如遇到尿97、98的曲目时过早终止, 99。然而, 使用与体外的 RNPs 合成的指南 rna 绕过这些问题, 并简化了指导设计的约束。从这些算法中产生的一个共同特征, 并已被证实在许多研究与高效的基因组编辑, 是存在嘌呤, 特别是鸟嘌呤, 在3′结束的指南的目标特定序列。该指南的特点是非常成功的有机体之间, 从哺乳动物到线虫, 果蝇和斑马鱼65,100,101。此外, 对于C. 线虫, 在指南目标区域的3′端设计具有 GG 二核苷酸的参考线是预测高效导 rna65的有效策略。理想情况下, 并行测试多个参考线, 以确定给定应用程序中哪个最成功。
当试图向基因组引入 dna 序列时, 捐赠者或模板 dna 的设计也至关重要。单链寡核苷酸捐赠者 (ssODNs) 比其他典型的修复模板, 线性双绞线和质粒 DNA54,55,102更可靠地插入。在某些位点上, HDR 效率可以通过与非目标或移位的 DNA 链互补的 ssODNs 来改进, 并且拥有长度不对称的同源臂27,55。由于修复模板正在入到剪切站点并包含目标序列 , 因此必须采取步骤防止 Cas9 在基因组插入之前或之后裂解捐赠者的 DNA 。这是通过对 PAM 序列或种子区域进行无声的突变来实现的, 它避免了 Cas9 的识别, 同时保留了插入基因21、103的功能。即使单核苷酸改变 PAM 可能会取消绑定104, 尝试改变至少四核苷酸是安全的。
意义和未来应用: 基因组编辑与 CRISPR-Cas9 已经成为一种强有力的方法, 使任何有机体的巧妙的基因操作。使用 Cas9 RNP 进行编辑时, 首先需要做一些努力, 但在实验室中建立试剂和协议后, 就可以直接使用了。用预组装的 RNP (而不是质粒 DNA) 编辑细胞可以提高总体编辑效率, 包括通过 HDR 难以实现的基因插入, 较少的目标效果24,25,26,27,29. 此外, 实验者避免了基因表达、RNA 降解、蛋白质折叠等问题, 以及在细胞22、23中分别合成的 gRNA 和 Cas9 分子之间的关联。RNP 编辑还绕过了在临床上使用病毒传递方法14时可能出现的插入突变和持续表达的安全问题。由于这些优势, 许多科学家进行了临床前, 概念验证的实验, 有利于 RNP 编辑的人类治疗应用。体内和前体基于 RNP 的基因组编辑方法正在开发中以治疗甚至治愈各种条件, 从诸如杜氏肌营养不良症105和镰状细胞疾病27的遗传疾病到HIV29和癌症11。有趣的是, Cas9 RNP 越来越被用作农业工程的交付方法, 因为它使 "无 DNA" 编辑植物33,34,36。

fThe CRISPR-Cas9 系统允许科学家改变任何基因组的目标区域1。这种快速而廉价的技术革命性地进行了基础研究, 并承诺对个性化疾病治疗、精准农业和超过2的发展产生深远的影响。CRISPR 编辑是一种民主化的工具, 在一个新的实验室中实施该系统并不需要在基因组工程学方面的专门知识, 仅仅是基本的分子生物学技能。研究人员现在可以用一些替代基因操作的方法来研究以前顽固的有机体3,4。仅在过去的五年里, CRISPR 基因组编辑已经被用来设计超过200种不同的脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物物种。
根据 CRISPR 原核防御通路, 特定于地点的基因组编辑所需的核心元素是 Cas9 蛋白, 通常来自化脓和密码子-通过增加的核定位信号 (NLS) 进行优化, 其专门RNA 指南5,6。虽然这里没有讨论, 其他 Cas9 orthologues 或 CRISPR 内切酶也可能被使用。自然发生的 gRNA 由两个分开转录的片断、CRISPR RNA (crRNA) 和反激活 crRNA (tracrRNA)7组成。这些 rna 可以融合成一个单一的转录, 称为单导 RNA (sgRNA)8。大多数基因组编辑器都选择了流线型的 sgRNA9, 尽管双导则也经常使用10,11。实验者选择20核苷酸 (nt) 基因组 DNA 目标, 确保它位于 Cas9 识别所需的短授权签名旁边, 称为 protospacer 相邻的母题 (PAM), 并设计一个包含互补序列的 gRNA12.
一旦细胞内, RNP 复合体定位其基因组目标, gRNA 基对与互补 dna 链, 然后酶的两个 dna 链, 以产生双链断裂2。细胞修复机械通过至少两条路线之一修复了争端解决机构: 通过容易出错的非同源的端接 (NHEJ) 通路或同源定向修复 (HDR), 它无缝地将含有 "双臂" 的 DNA 包含在断裂的两边。前者的修复途径通常导致 indel 形成和随后的基因中断, 而后者则允许实验者插入或改变 DNA 序列1。
编辑效率和准确性取决于 Cas9 和 gRNA 进入单元格的方法。这些组件可以以核酸的形式传递给培养的细胞、胚胎或有机体, 或者作为预装 RNP 复杂的13、14、15。常见的核酸的传递方法包括病毒转导, 转染, 或电穿孔的 mRNA 或质粒 DNA。Cas9 蛋白和导 RNA 在细胞内产生, 它们联想形成一个复合体。
RNP 的直接传递需要分离纯化 Cas9 蛋白和引导 RNA。这可以在内部做, 或者蛋白质和 sgRNA 可以从几个商业供应商之一购买。一旦获得, Cas9 和 gRNA 混合形成酶能力的 RNP 复杂, 并引入细胞直接注射到受精卵/胚胎, 脂质为基础的转染16, 或电穿孔。RNP 编辑的第一个报告涉及注入C. 线虫性腺17。微注射仍然是将 RNP 引入胚胎和整个生物体的首选方法, 尽管在鼠标18、19和鼠20胚胎中已经显示有效的电穿孔。我们描述直接将 RNP 注入线虫性腺和P. hawaiensis胚胎的协议, 并推荐一种特殊类型的电穿孔, 用于在编辑主要人体细胞时提供 RNP。这种方法, nucleofection, 涉及优化的电穿孔程序和细胞类型特定的解决方案, 并允许 RNP 进入细胞质和核的21。
基因组编辑与 RNP 提供了几个明显的优势。由于蛋白质和 RNA 成分是预先组装, 质量可以确保在交付之前, RNP 编辑避免了许多陷阱与核酸的交付。也就是说, 没有 Cas9-encoding DNA 整合到宿主基因组的风险, mRNA 永远不会被暴露为退化, 它绕过了体内gRNA 或蛋白质表达、折叠和关联22、23的问题。此外, 使用 RNP 导致毒性降低, 离目标事件远少于以质粒为基础的表达式, 这是由于 RNP 在单元格中的半衰期更短的半生命周期24,25,26,27。
最后, RNP 编辑可明显导致在各种人类细胞系的高编辑率, 主要细胞, 如成纤维细胞, 胚胎干细胞 (ESCs), 诱导多能干细胞 (iSPCs), HSPCs 和 T 细胞16,24, 25,26,27,28,29;在无脊椎动物, 包括线虫, P. hawaiensis, 果蝇3,17,30;如斑马鱼、老鼠和老鼠的脊椎动物,31,32;植物种类包括拟南芥、烟草、生菜、大米、葡萄、苹果、玉米和小麦33、34、35、36;在衣藻、青霉和念珠菌种类37,38,39。当使用 RNP 与质粒传递相比, indel 形成的频率会更高, 而 HDR 介导的 DNA 插入可以更容易实现25,27,29。
此处描述的协议使用 Cas9 RNP, 是一种有效的、易于适应的技术, 可直接应用于各种生物系统40、41, 特别是在其他难于工作的单元格中。与和在有机体, 不用完善的系统为精确基因操作。我们首先描述如何设计、获取和组装 Cas9 RNP, 然后再覆盖其在不同模型细胞类型和有机体中的使用。造血干/祖细胞 (HSPCs) 和 T 细胞的编辑使用相同的方法, nucleofection, 因此, 它们被覆盖在该协议的步骤2和3。编辑C的过程。线虫在步骤4和5以及P中进行描述。hawaiensis编辑包括在步骤6和7中。最后, 由于任何有机体的基因编辑实验的成功都可以通过基因型测序来评估, 子步骤描述了《议定书》中所描述的所有细胞和有机体可能的分析方法, 步骤8中概述了这一点。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents/Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td>IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1</td></tr><tr><td>Guide RNAs</td><td>Synthego</td><td>-</td><td>Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1</td></tr><tr><td>Purified Cas9 protein (EnGen&amp;nbsp;Cas9 NLS,&amp;nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option</td></tr><tr><td>Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&amp;nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&amp;trade; Human T Cell Isolation Kit</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>cell culture plate, 96 wells, round</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500-pack IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Nematode Growth Media agar in petri dishes</td><td>-</td><td>-</td><td>See Stiernagle, T (ref. 59)</td></tr><tr><td>Standard borosilicate glass capillaries with filament:&amp;nbsp; 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass; 24 &amp;times; 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass; 22 &amp;times; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE agarose</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90 plasmid</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>Compressed nitrogen</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mM culture dishes</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (100 &amp;times; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tungsten wire (0.005 in. diameter)</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoroalkoxy alkane (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marine salt</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; pasteur pipettes</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&amp;nbsp;Stereomicroscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>Coarse manipulator</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol)</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (for P. hawaiensis protocol)</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enhanced genome editing with cas9 ribonucleoprotein in diverse cells and organisms

站点特定的真核基因组编辑与 CRISPR (聚集定期 interspaced 短回文重复)-Cas (CRISPR 相关) 系统已迅速成为一个普遍的研究人员寻求广泛的各种生物学问题。用户最常使用从链球菌化脓派生的 Cas9 蛋白, 并具有易于重新编程的指南 RNA (gRNA)。这些成分被引入细胞, 并通过与双链 DNA (dsDNA) 基因组的互补区域的基础配对, 该酶将两股形成双链断裂 (争端处理)。随后的修复将导致随机插入或删除事件 (indels), 或将实验者提供的 DNA 纳入断点地点。
使用纯化的单导 RNA 和 Cas9 蛋白, 预装形成 RNP 并直接传递给细胞, 是实现高效基因编辑的有效途径。RNP 编辑特别提高了基因插入的速度, 这一结果往往是难以实现的。与通过质粒进行传递相比, 细胞内 Cas9 RNP 的持续时间越短, 就会导致离靶事件减少。
尽管它的优势, 许多 CRISPR 基因编辑的休闲用户不太熟悉这种技术。为了降低进入门槛, 我们概述了在一系列背景下实施 RNP 战略的详细协议, 突出了其独特的优点和不同的应用。我们涵盖了两种类型的主要人类细胞, T 细胞和造血干细胞/祖细胞 (HSPCs) 的编辑。我们还展示了 Cas9 RNP 编辑如何使整个有机体的简单的基因操作, 包括经典模型蛔虫秀丽线虫和最近引入的模型甲壳类, Parhyale hawaiensis。

这些实验表明, 预组装 Cas9 RNP 可以用来操纵基因组的原细胞和整个有机体。研究人员纯化或购买 Cas9 蛋白和 sgRNA, 将这两种成分结合在一起预先形成复合物, 并将 RNP 引入其细胞或生物体中。在允许足够的时间进行编辑和下一代后代出生 (如果适用), 检查表型和/或收集细胞的基因分型。表型可以通过功能化验, 表达分析, 可视化 (眼睛或显微镜), 或其他方法, 根据实验。
例如, 经过编辑以纠正导致镰状细胞疾病的β-球蛋白突变的 HSPCs 可以分化为红细胞, 用于生产健康或镰状血红蛋白27,87 (图1). T 细胞编辑, 以敲出高亲和 IL-2 受体基因, CD25 (IL2RA), 可以分析的表面染色和流式细胞术88, 并功能分析, 以检测信号响应 IL-2 刺激 (图 1B).t 细胞也可以重新编程在许多临床重要的方式, 需要评估不同的表型, 包括艾滋病毒感染的功效89和体内抗肿瘤疗效的车 T 细胞11。
使用共同 CRISPR/联合转换筛选方法, C. 线虫蠕虫在两个位点62同时编辑。使用 ssODN 修复模板的dpy-10引用基因的 HDR 会导致一个容易得分的显性dpy-10增益函数突变。异型 F1dpy-10 (gof)动物是滚筒 (卷) 和合合dpy-10 (gof)动物是矮胖的 (dpy)。表型的存在表明, Cas9 编辑发生在这些动物, 并提高了识别一个编辑事件的可能性, 在第二个轨迹在轮或 Dpy F1动物。成功的编辑实验应导致33-50% 注入的 P0蠕虫产生20或更多 F1子代, 它们是 Dpy90。然后, 可以选择非 "动物" 返回dpy-10以 wildtype 并选择用于纯合编辑的兴趣。作为一个经验法则, crRNA 靶向 CRISPR 参考基因的浓度应该是 crRNA 靶向感兴趣基因的一半。如果不恢复兴趣基因的编辑, 可以调整两个 CRISPR rna 的比值, 以增加恢复所需突变的可能性。例如, 增加兴趣基因的 crRNA 的数量相对于参考基因 crRNA 将增加蠕虫的数量在蠕虫的人口的兴趣基因编辑的百分比也拥有编辑在参考基因位置。Co 转换频率各不相同, 但速率通常为 20-60%, 通常在 F1生成中产生纯合编辑 (图 1C)。
P. hawaiensis已编辑以敲除腹部 b基因 (和 b) 的幼仔显示清晰的形态学异常3 (图 1D)。这种基因是需要正确的腹部模式, 它的中断导致胸部类型的跳跃和步行腿取代游泳和锚腿, 通常存在的腹部。
在基因型层面确定基因组编辑结果需要测序或检测序列变化的体外检测。在这里, 我们显示了典型的序列数据从我们的模型细胞类型和有机体, 强调不同的方法来编辑量化。请注意, 图形标签是一般化的, 因为此处显示的所有方法都可以应用于任何生物系统。
基于排序的方法因技术复杂性和结果深度而异。对于克隆编辑的种群或容易分离的个体有机体, 编辑的个体可以在基因组 DNA 提取之后进行排序。标准的 Cas9-cut 排序结果将在给定的个体中显示该站点中的序列更改, 假设 frameshifts 会中断其功能 (图 2a)。用于排序的在线工具是另一个基于排序的方法, 可应用于混合种群, 而不是单个突变体78。序列的分析与在线工具, 可以近似整体编辑效率和主要顺序结果。代表数据显示在图 2B中。
这里描述的最彻底的测序方法是深度测序 (有时称为高通量或下一代测序)。该方法提供了混合种群中单个基因组的 DNA 序列。这些数据可以用多种方式加以说明。在这里, 我们根据编辑结果 (图 2C) 将单个排序读取从编辑的单元格中分类。大多数细胞通过 NHEJ 通路进行编辑, 这通常会导致基因中断。在其他方面, 通过 HDR27, 目标基因已被替换为备用版本。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg"> 表 1: 对初步基因组编辑实验的积极控制.本表显示了在本议定书所述的每个细胞和有机体中执行第一次基因组编辑实验所需的关键信息。以下这些参数很可能产生一个成功的结果, 可以用来测试协议或作为比较基准, 一旦实验者的目标是自己感兴趣的基因。F: 向前, R: 反向, HDR: 同源定向修复。<a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">请单击此处下载此表.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg"> 图 1: 具有代表性的表型结果来自 Cas9 RNP 编辑的主要人类细胞和有机体。(A)这是一种高效液相色谱示踪, 表明在基因组编辑成功后, 分化为晚期孵育的 HSPCs 将产生比镰状血红蛋白更多的功能性血红蛋白。突变红细胞产生镰状血红蛋白 (哈佛商学院), 而成功编辑的细胞将产生健康的血红蛋白 (HbA 和 HbA2) 以及胎儿血红蛋白 (HbF)。吸光度以任意单位 (au) 为图表。本小组首次在德威特电子杂志上发表.t 。27. 它在美国科学促进协会的允许下重印。(B)在左侧, 对于每个条件, 此面板显示流式细胞仪数据, 表明在CD25基因被 RNP 击倒后, 表面染色的 T 细胞不会表达 CD25。CD25 丰度绘制在 x 轴上, 单元格大小在 y 轴上。在右侧, 对于每个条件, 此面板显示 Phospho-Stat5 (pStat5) 量化后, 诱导与 IL-2。当 IL-2 受体缺失时, 信号减少 (CD25 )。在 x 轴上绘制 pStat5 丰度, 并垂直比较三个不同级别的 IL-2 输入所产生的数据。(C)此面板显示秀丽线虫co CRISPR/共转换屏幕, 其目标是dpy-10作为协转换标记。两个引导 rna 目标两个位点, dpy-10和您最喜爱的基因 (yfg), 在同一 P0注射的动物。在dpy-10上的 HDR 结果为 dpy 表型。选择 Dpy1动物会增加在第二个轨迹上识别编辑的几率。(D)此面板显示 wildtype Parhyale hawaiensis幼仔有正常的腹部与游泳和锚腿。B 型敲出的幼仔 (F0个体) 开发腹部向胸部转变。因此, 游泳和锚腿已经消失, 并取代了跳跃和步行腿与正常的胸部。<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg"> 图 2: 编辑结果分析方法的典型结果。(A)此面板显示了来自单个 F1 hawaiensis有机体的桑格测序结果的示例, 包括 wildtype 序列和三种不同的 indels, 通过移开阅读框架来破坏基因功能。(B)这些潮汐结果显示在序列化 T 单元格池中的 Cas9-target 站点上发生的插入和删除事件的范围。x 轴指示核苷酸中给定插入或删除的长度。(C)这些深度测序结果显示没有 nucleofection 或 gRNA 的基因组编辑, 并且成功编辑了完整的 Cas9 RNP, 按 HSPCs 的 DNA 修复结果分组.<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的更大版本.</a>

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Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体

利用预装 Cas9 ribonucleoprotein 复合体 (RNP) 是精确、高效的基因组编辑的有力方法。在这里, 我们强调它的效用横跨广泛的细胞和有机体, 包括主要的人类细胞和经典和新兴的模型有机体。

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

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