11.18 : Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Elutionsprozess

In der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist der Elutionsprozess entscheidend für die Trennung der Analyten und die Qualität der chromatographischen Ergebnisse. Die Elution beschreibt, wie sich Verbindungen durch die Säule bewegen und sich basierend auf ihren Wechselwirkungen mit der mobilen und stationären Phase trennen. Dieser Prozess bestimmt die Auflösung, die Peakform und die Retentionszeiten im Chromatogramm, die für die Identifizierung und Quantifizierung von Komponenten in komplexen Mischungen unerlässlich sind. Das Verständnis des Elutionsprozesses hilft bei der Interpretation chromatographischer Daten und der Verbesserung der Trenneffizienz.

Bei der HPLC werden hochreine Lösungsmittel in HPLC-Qualität verwendet, um minimale Störungen durch Verunreinigungen sicherzustellen. Hochwertige Lösungsmittel sind unerlässlich, da selbst kleinste Mengen von Kontaminationen den Elutionsprozess stören, die Peaks im Chromatogramm verzerren und die Empfindlichkeit während der Probenerkennung verringern können. Darüber hinaus können Lösungsmittel gelöste Gase wie Stickstoff und Sauerstoff enthalten, die ebenfalls die Probenerkennung beeinträchtigen können. Um diese Gase zu entfernen, wird entweder eine Vakuumpumpe oder eine Spülung mit Heliumgas verwendet, um die Integrität der Trenn- und Detektionsprozesse aufrechtzuerhalten.

Die entgasten Lösungsmittel werden dann von einer Hochdruckpumpe aus dem Reservoir der mobilen Phase gezogen. Am häufigsten wird hierfür eine Kolbenpumpe verwendet. Die Pumpe besteht aus einem Kolben und zwei Rückschlagventilen, die das Lösungsmittel durch die Hin- und Herbewegung des Kolbens ansaugen. Ein Nachteil der Kolbenpumpe ist jedoch, dass sie einen gepulsten Lösungsmittelfluss erzeugt. Daher ist bei modernen HPLC-Systemen ein Pulsdämpfer an die Pumpe angeschlossen, um dieses Problem zu lösen. Andere Pumpen, wie z. B. schraubengetriebene Verdrängerpumpen, sind erhältlich, weisen jedoch Einschränkungen auf, wie z. B. eine geringere Lösungsmittelkapazität und eine niedrige Druckbelastbarkeit, wodurch sie für Lösungsmittelwechsel weniger praktisch sind.

Es gibt zwei Arten von Elutionsprozessen: isokratische Elution und Gradientenelution. Bei der isokratischen Elution wird während der gesamten Trennung ein einziges Lösungsmittel oder eine einzige mobile Phase verwendet, während bei der Gradientenelution die Zusammensetzung während des Trennprozesses geändert wird. Diese Methode verbessert die Trennleistung, verkürzt die Analysezeit und verbessert die Auflösung, was zu schärferen Peaks im Chromatogramm führt. Die Gradientenelution bietet eine bessere Auflösung und führt zu präziseren und stärker getrennten Peaks, was die Interpretation des Chromatogramms bei komplexen Gemischen im Vergleich zur isokratischen Elution erleichtert.

Bevor die mobile Phase in die Säule gelangt, wird die Probe mithilfe eines Schleifeninjektors mit einem Zweipositionsventil eingeführt. Das Ventil hilft dabei, die mobile Phase zur Säule zu leiten. Aufgrund des hohen Drucks bei der HPLC kann die Probeninjektion nicht wie bei der Gaschromatographie (GC) durchgeführt werden. Probenschleifen mit festen Volumina von 0,5 Mikrolitern bis 2 Millilitern können austauschbar sein.