12.14 : Fluoreszenz und Phosphoreszenz: Instrumente

Fluorometer und Spektrofluorometer sind zwei Arten von Instrumenten zur Messung der molekularen Fluoreszenz. Diese Instrumente unterscheiden sich in der Art und Weise, wie sie Anregungs- und Emissionswellenlängen auswählen, und in der Art der verwendeten Lichtquellen. Fluorometer verwenden Absorptionsinterferenzfilter, um Anregungs- und Emissionswellenlängen auszuwählen. Die Anregungsquelle in einem Fluorometer ist normalerweise eine Niederdruck-Quecksilberdampflampe, die intensive Linien aussendet, die über den gesamten ultravioletten und sichtbaren Bereich verteilt sind. Während Fluorometer für quantitative Arbeiten geeignet sind und die Fluoreszenzintensität messen können, können sie keine Anregungs- oder Emissionsspektren aufzeichnen.

Im Gegensatz dazu verwenden Spektrofluorometer einen Monochromator, um Anregungs- und Emissionswellenlängen auszuwählen. Diese Instrumente verwenden eine Hochdruck-Xenonbogenlampe als Anregungsquelle, die ein kontinuierliches Emissionsspektrum erzeugt. Spektrofluorometer können Anregungs- oder Emissionsspektren aufzeichnen, was eine detailliertere Fluoreszenzanalyse ermöglicht. Zudem eignen sie sich auch für quantitative Messungen.

Im Fall der molekularen Phosphoreszenz ist eine spezielle Instrumentierung erforderlich, die als Phosphorimetrie bezeichnet wird, um zwischen Phosphoreszenz und Fluoreszenz zu unterscheiden. Phosphoreszenz hat eine längere Lebensdauer als Fluoreszenz, sodass zwischen der Anregung und der Messung der Phosphoreszenzemission eine Verzögerung auftritt. Dies kann durch die Verwendung von zwei Choppern erreicht werden, die phasenverschoben rotieren. Die Chopper blockieren die Fluoreszenzemission, wenn die Anregungsquelle auf die Probe fokussiert ist, und blockieren die Anregungsquelle bei der Messung der Phosphoreszenzemission. Um eine Deaktivierung des angeregten Zustands durch externe Konversion zu verhindern, eine Form der strahlungslosen Entspannung, bei der Energie auf das Lösungsmittel oder die Probenmatrix übertragen wird, anstatt als Licht emittiert zu werden, werden Proben für Phosphoreszenzmessungen typischerweise in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst und bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff eingefroren. Dadurch entsteht eine optisch klare feste Matrix, die die externe Konversion minimiert. Alternativ kann die Probe auf einem festen Substrat immobilisiert werden, wodurch eine Phosphoreszenzmessung bei Raumtemperatur ermöglicht wird.