Zu wissen, was zählt: Unbiased Stereology in der nicht-menschlichen Primaten Gehirn

Zusammenfassung

Die anatomische Organisation des Primas Gehirn kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern. Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bezugsraum ¹.

Zusammenfassung

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für das Verständnis der normalen Funktion und Krankheit Prozesse des menschlichen Gehirns. Unvoreingenommene Stereologie, die Methode als state-of-the-art für die Quantifizierung von biologischen Objekten in Gewebeschnitten akzeptiert

Protokoll

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe sollte nach Burke et al durchgeführt werden. (2009) ^5.

1. Kurz gesagt, sollten Gewebe gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. Tissue sollte gut mit paraformaldeyhde, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen, Volumen bestimmt, cryoprotected und gefrorenen ^5.

Teil 2: Systematische Sampling von Gewebe nach Burke et al. (2009) ^6.

1. In diesem Beispiel haben wir uns auf den Stirnlappen des Gehirns vervet. Der Verweis Raum wurde definiert, um kortikale Gewebe aus dem zentralen Sulcus der frontalen Pol der linken Hemisphäre gehören. Für unsere Zwecke der Folge wurden in 1 / 10 Sektionen in der gesamten Hirnrinde, im Schnitt bei 50 um gesetzt. Eine komplette Serie wurde mit Kresylviolett (Serie # 1) gefärbt. Serie 2 wurde aufgeteilt, so dass die Hälfte der Schnitte wurden mit Goldchlorid für Myelin Offenbarung und die andere Hälfte gefärbt Acetylcholinesterase (zur Abgrenzung von bestimmten subkortikalen Bereichen) gefärbt. Alle anderen Serien wurden in Antigen erhalten im Rahmen unserer langfristigen Forschungs-Pläne überhöht.

Teil 3: Stereology (weitere Einzelheiten siehe Mouton 2002) ⁴

1. Die Gesamtschätzung der Zellzahlen (N) wird auf der Grundlage der folgenden Gleichung berechnet:
   N = ssf -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q -
   Wo ssf Abschnitt Auswahlsatz ist, asf Bereich Sampling-Fraktion, TSF, wenn die Dicke Auswahlsatz (wo der gemessenen Dicke des Gewebes wird durch die Dissektor Höhe geteilt), und Σ Q - ist die Gesamtzahl der Objekte von Interesse gezählt innerhalb der Dissektor. Die nächsten Abschnitte dieses Protokoll zeigen, wie die SSF, asf, TSF und Σ Q zu bestimmen.
   
2. Section Sampling Fraction (non-computer based)
   1. Die gesamte Referenzraum müssen auch von vorne nach hinten und dorsal werden, um ventral definiert. In diesem Beispiel waren wir daran interessiert, den Frontallappen und definiert sie als die Region von der Spitze des frontalen Pol (anterior) an den zentralen Sulcus (posterior) und der lateralen Sulcus (ventral) und die Insula ausgeschlossen.
   2. Für den Frontallappen von diesem speziellen Thema insgesamt 760 Schnitte wurden systematisch mit 76 gefärbt Kresylviolett gesammelt. Da das Ziel 10 Abschnitte wurde während der Referenz-Raum 1 / 6 Kresylviolett gefärbten Schnitte wurden Proben entnommen, was zu einer Section Probe Anteil von etwa 1 / 60. Wir zufällig begann mit einer der ersten 6 Kresylviolett gefärbten Schnitten und systematisch abgetastet 1 / 6 danach. Insgesamt 13 Abschnitte wurden für das ausgewählte Motiv (Abbildung 2) abgetastet.
3. 
   Bereich Probenfraktion (computer-based)
   
   1. Eine Pilotstudie zeigt die optimale Rasterweite, der Area Sampling Fraction, die Referenz-Raum mit ca. 100-300 disectors Probe. Innerhalb der Frontallappen, ergab eine Maschenweite von 2500 um ² einen Schnitt von 254 disectors für dieses Thema (Abbildung 2). Die Größe der disector sollte zwischen etwa 0-5 gezählt Objekte, in diesem Fall Neuronen ergeben.
4. Dicke Probenfraktion (computer-based)
   1. An jedem disector Lage, ist die Höhe des Gewebes gemessen, und ein Bruchteil dieser Höhe wird abgetastet, das ist wie die Dicke Sampling Fraktion bekannt. Zur Bestimmung der gemessenen Dicke über der z-Ebene zu konzentrieren, bis die erste Zelle rückt in den Fokus, dann wieder leicht nach oben an die Spitze des Abschnitts, dh bis das letzte Objekt erscheint nur unscharf. Zur Bestimmung der Unterseite des Gewebes durch die z-Ebene zu konzentrieren, bis die Zellen kaum sind unscharf.
   2. Fokussierung durch die z-Ebene sollten die Zellen in jeder Tiefe gefärbt werden, falls nicht, kann dies ein unvollständiges Eindringen der Flecken oder ungleichmäßige Austrocknung des Gewebes zeigen, in welchem ​​Fall die Abschnitte sollten re-gefärbt werden. Diese Vorsichtsmaßnahme ist besonders wichtig für immungefärbt Gewebe, das Eindringen von immunoprobes erfordert durch relativ dicke Gewebeschnitte. Aus diesem Grund sollte immungefärbt Gewebe leicht mit einem basophile Färbung (zB Kresylviolett, hema gegengefärbt werdentoxylin), um genau zu bestimmen, Ober-und Unterseite des Profils und das Eindringen des Antikörpers zu bestätigen. In dieser Studie wurden die Schnitte auf einem Mikrotom Einstellung von 50 um in Scheiben geschnitten. Nachdem alle Gewebe Verarbeitung abgeschlossen war, lag der gemessene Gewebedicke 17.9μm (Abbildung 2), mit einer mittleren Schrumpfung von etwa 65%. Beachten Sie, dass diese Ergebnisse typische Schrumpfung stellen für die Gewebe für die Routine histologischen Präparat ⁷ verarbeitet.
   3. Der Standardwert disector Höhe für den typischen Studie ist 10 um. Der Unterschied zwischen den disector Höhe und die gemessene Schichtdicke ist die Dachhöhe, das Volumen des Gewebes, wo keine biologischen Funktionen sind gezählt. Die Verwendung einer Dachhöhe vermeidet Gewebeschäden an der Schneide Oberflächen (zB verloren Caps).
5. Die Gesamtzahl der Objekte gezählt, Σ Q -
   1. Zur Vermeidung von Verzerrungen aus Erkennungsfehler, ist es unerlässlich, dass eine einheitliche Definition für die jeweilige biologische Funktion von Interesse verfolgt wird. In diesem Fall waren wir daran interessiert, das Zählen Neuronen. Daher wurde ein Neuron als mit einer sichtbaren zentral gelegenen Nucleolus und ein klar definiertes Zytoplasma, während Gliazellen in der Regel fehlten sichtbare Nukleolen und Zytoplasma definiert. Zu diesem Thema 457 Neuronen wurden gezählt.

Teil 4: Stereologer - A Computerized Stereology System (Stereology Resource Center, Chester, MD)

1. Die Stereologer-System fordert den Benutzer beim Ausfüllen der notwendigen Informationen in einer Schritt-für-Schritt-Mode. In der "Study Information" die Parameter der Studie sind etabliert. Da ein Verweis Platz für die Studie definiert werden müssen, sollten Sie die Lautstärke-Parameter ausgewählt (für den Bezugsraum der Cavalieri Schätzer sollte so gewählt werden). Object Lautstärke kann auch hier gewählt werden, um die Anzahl-gewichteten Volumen für die Bevölkerung der Objekte von Interesse zu schätzen. Für unser Beispiel wurde nur das Volumen des Referenz-Raum gewählt. Für jedes Objekt, wählen Sie die Anzahl und die Definition der Funktion von Interesse, in diesem Fall Neurons.
2. Fall Initialisierung: In diesem Abschnitt werden die Probenahme Informationen nachgewiesen wird. Geben Sie die Platte Abtastintervall (wenn getrennte Platten des Gewebes wurden vollständig und in Scheiben geschnitten auf jeder Seite in Reihenfolge platziert und geben Sie dann 1 hier). Geben Sie die Gesamtzahl der Schnitte durch den Verweis Raum (in diesem Fall 760) übernommen. Geben Sie dann den Abschnitt Abtastintervall (in diesem Fall 59). Das System berechnet dann die Zahl der Sektionen zu beproben (in diesem Fall 13).
3. Probe-Parameter: Dieser Abschnitt definiert das Raster und disector Größe. Für das Volumen, verwenden Sie eine geringe Vergrößerung 2.5x-10x auf die Raster unter dem Edit-Menü zu definieren. Object Vergrößerung sollte auf 100x (NA 1,3 oder 1,4) durchgeführt werden. Frame-Bereich ist die Größe des disector, in diesem Fall haben wir 50% Bildschirm. Die Rahmenhöhe beträgt die Dicke der disector; gesetzt bei 10 um hier. Die Spantabstand ist die Größe des Rasters. In unserer Pilotstudie haben wir festgestellt, dass 2500μm Erträge zwischen 150-200 Bilder in einem systematisch-einheitlicher Weise durch eine relativ große Referenz-Raum verteilt. Für kleinere Flächen sollte ein kleineres Rastermaß verwendet werden. Eine Pilotstudie identifiziert die optische Sonde Parameter für jeden einzelnen zu studieren.
4. Nach dem Studium Parameter festgelegt wurden, kann die Probenahme durch das Gewebe vor. Das Programm wird Sie auffordern, den ersten Abschnitt Probe. Schritt 1: Das Programm wird der Benutzer aufgefordert, bei schwacher Vergrößerung, um die Referenz-Platz auf dem Abschnitt zu verfolgen. Das System wird dann einen Raster über den Abschnitt über die Sonde Parameter und der Benutzer basieren, werden dann sicher, dass Punkte fallen in den Referenz-Raum. Wenn ein Punkt nicht innerhalb der Referenz-Raum einfach auf den Punkt klicken und werden nicht in das Volumen berechnet werden. Schritt 2: Das System wird ein neues Raster über die Referenz-Raum zu platzieren, basierend auf dem Spantabstand Parameter. Überprüfen Sie, ob die Schnittpunkte fallen in den Referenz-Raum. Schritt 3: Das System wird dann den Benutzer auffordern, auf die höhere Vergrößerung Ziel wechseln und die Bühne zum ersten Dissektor. Schritt 4: An diesem Punkt das System fordert den Benutzer auf die Definition Ober-und Unterseite des Abschnitts dann setzt das System die Probenahme Platz in der z-Achse. Schritt 5: Der Benutzer wird dann auf jedes Objekt, das innerhalb der disector fällt durch die z-Ebene klicken. Objekte, die die roten Linien oder der Unterseite des disector berühren kann nicht gezählt werden. Nachdem jedes Objekt gezählt wird, klicken Sie auf Weiter. Die Bühne wird zum nächsten disector und Schritte 4 und 5 wiederholen bewegen wird. Sobald alle disectors für den Abschnitt wurden gezählt, das System wird der Benutzer aufgefordert, die nächste fortlaufende Abschnitt einfügen, um sondiert werden. Schritte 1-5 werden wiederholt, bis alle die sequentielle Abschnitte werdenabgetastet worden. Das System wird dann die Berechnungen für asf, ssf, TSF und Σ Q. Basierend auf diesen Parametern, erzeugt das System einen geschätzten N, Referenz-Lautstärke und CE ist sowohl für die geschätzte Anzahl und Volumen. Es wird auch Empfehlungen effizienter zu werden oder die CE (Abbildung 2) zu reduzieren.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

Unvoreingenommene Stereologie bietet effiziente und zuverlässige Schätzungen von Zellpopulationen in einem Referenz-Raum. Es gibt eine Reihe von Computer-based stereologische Systeme zur Verfügung, die alle auf eine systematische Probenahme und eine definierte Referenz-Raum verlassen. Wir haben die BioQuant Life Sciences-System verwendet werden, um die gesamte neuronalen Population der Großhirnrinde von 2-jährigen Meerkatzen Schätzung mehr als 828 Millionen (Abbildung 3) mit einem durchschnittlichen CE von 0,042 werden. Wir haben anschließend die Stereologer System verwendet, um schätzen, dass der Frontallappen für etwa die Hälfte der Zahl der kortikalen Neuronen ^8.

Abbildung 1 Computer-based Stereology Systems. Das Basis-Set-up des Stereologie Systeme ist der gleiche, ein Mikroskop mit einem motorisierten Stufe (xyz), eine Bühne Controller, Videokamera, Computer und Software. Das System, das letztlich gewählt wird, sollte auf Effizienz, Bedürfnisse und Kosten-Analyse zugrunde liegen.

Informationen zum Studium
Study Namen	Frontal Cortex
Principal Investigator	MB
Spezies	AG
Reference Raum Frontal	Kortex
Hinweise
CASE INFORMATION
Data Collector	MB
Datum	Mittwoch, 30 April, 2008
Gruppe	Kontrolle
Thema	O26
Hinweise
Abtasteigenschaften
Slab Sampling Interval	1
Gesamtzahl der Sektionen	760
Section Sampling Interval	59
Ab Section	2
FRAKTIONEN
ASF	0,0002
SlabSF	1,0000
SSF	0,0169
TSF	0,5587

ERGEBNISSE Zusammenfassung
Parameter	Sonde	Name	Ergebnis	CE	SD
Dicke	---	---	17,8996 μ	---	---
Anzahl	Disector	Neuron	243833769.1473	0,0474	N / A
Volumen	Cavalieri Punktraster	Volumen	1719769397954.1284 μ ^ 3	0,0078	N / A

EMPFEHLUNGEN
Sonde	Objekt-Nummer (Neuron)
CE	0,0474
Empfehlungen	CE ist akzeptabel.

Anzahl der Disectors gesehen zu hoch ist, erhöhen Disector Abstand.
Sonde	Region Volume (Lautstärke)
CE	0,0078
Empfehlungen	CE ist akzeptabel.

ABSCHNITT ERGEBNISSE
Abschnitt	Neuron NumObjects Neuron NumCorners	Volumen RegPoints
1. 40	48	34
2. 26	52	44
3. 29	56	48
4. 39	100	83
5. 49	112	83
6. 53	156	120
7. 65	128	106
8. 45	108	100
9. 52	100	77
10. 26	64	60
11. 21	44	44
12. 11	36	32
13. 1	12	6

Abbildung 2 Ergebnisse der Fontal Lobe den Stereologer System erhalten. Für den Stirnlappen, der längste Teil des stereologische Prozess in die systematische Entnahme und Schneiden war. Topographie, Volumen und neuronalen Schätzung wurden in etwa einen Tag für jedes Fach abgeschlossen. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt.

Abbildung 3 Cortex neuronalen Population Estimate mit BioQuant erhalten. Die BioQuant System erfordert eine genaue Topographie vor Zellzählung. Hier durchschnittlich 13 Schnitte wurden beprobt. Kortikale Topographie und die anschließende Volumen Schätzung nahm zwischen 15-20 Stunden für jedes Fach. Topographie wurde unter einem 2.5x Ziel durchgeführt und Zählung erfolgte unter Verwendung eines 100x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,3). Jeder 100. Abschnitt wurde in der linken Hemisphäre mit durchschnittlich 180 disectors abgetastet gewählt. Nach der Topographie wurde abgeschlossen neuronalen Zählung dauerte etwa einen Tag. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt.

Diskussion

Unvoreingenommene Stereologie in einem Primaten Gehirn ist ähnlich wie bei anderen biologischen Proben. Doch angesichts der Größe des Primatengehirn, ist eine sorgfältige Verarbeitung Plan empfohlen, da eine einzelne Hemisphäre des grünen Meerkatze liefert mehr als 1200 Teile, wenn sie bei 50 um in Scheiben geschnitten. Zunächst empfehlen wir stereotaxically blockiert das Gehirn in 1 cm-Blöcke, die eine Standard-Schnittfläche zwischen den Blöcken und Themen bietet, minimiert Teilstrecken zwischen den Blöcken ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereologer	Stereology Resource Center (Chester, MD)	www.disector.com
Stereology Tool-Kit Stereologer system	BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)
StereoInvestigator	MBF Bioscience