Method Article
Wir beschreiben einen In vivo Fluoreszenz-Imaging-Protokoll, um die Regeneration der Muskulatur von GFP-markierten Myoblasten Monitor nach der Transplantation in der Skelettmuskulatur von gesunden und dystrophischen Mäusen. Dieses Protokoll kann angepasst an die Regeneration der Muskulatur durch die Transplantation von anderen Arten von Zellen und in anderen Muskelerkrankungen sowie zu studieren.
Muskeldystrophien sind eine Gruppe von degenerativen Muskel-Erkrankungen, die durch fortschreitenden Verlust der kontraktilen Zellen gekennzeichnet. Derzeit gibt es keine kurative Behandlung nicht möglich. Jüngste Fortschritte in der Stammzellbiologie haben neue Hoffnungen für die Entwicklung wirksamer Therapien Zelle erzeugt werden, um diese Krankheiten zu behandeln. Transplantation von verschiedenen Arten von Stammzellen mit fluoreszierenden Proteine in Muskeln der dystrophischen Tiermodellen beschriftet wurde weitgehend in das Feld verwendet. Eine nicht-invasive Technik mit der Möglichkeit, die transplantierten Zellen Schicksal track längs können weiter unsere Fähigkeit, Muskel-Transplantation von transplantierten Zellen genauer und effizienter zu bewerten.
In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass in vivo Fluoreszenz-Imaging ist eine sensible und zuverlässige Methode für die Verfolgung von transplantierten GFP (Green Fluorescent Protein)-markierten Zellen in Maus Skelettmuskeln. Trotz der Besorgnis über die Hintergründe durch die Verwendung eines externen Licht notwendig für die Anregung des fluoreszierenden Proteins, fanden wir, dass, indem Sie entweder Nacktmaus oder Beseitigung Haar mit Haarentfernung Reagenzien viel von diesem Problem beseitigt ist. Mit einer CCD-Kamera, kann das Fluoreszenzsignal in den Tibialis anterior (TA) Muskel nach der Injektion von 5 x 10 5 Zellen entweder von GFP transgenen Mäusen oder eGFP transduziert Myoblasten Kultur erkannt werden. Für weitere oberflächliche Muskeln wie dem M. extensor digitorum longus (EDL), Injektion von weniger Zellen produziert ein nachweisbares Signal. Signalintensität gemessen und quantifiziert werden, da die Anzahl der emittierten Photonen pro Sekunde in einer region of interest (ROI). Da die aufgenommenen Bilder klare Grenzen zur Abgrenzung der transplantierten Bereich zeigen, kann die Größe der ROI sowie gemessen werden. Wenn die Beine konsequent jedes Mal positioniert sind, spiegeln die Veränderungen in der Gesamtzahl der Photonen pro Sekunde pro Muskelgruppe und die Größe der ROI die Änderungen in der Zahl der transplantierten Zellen und die Größe des eingepflanzten Bereich. Die Veränderungen in den gleichen Muskel im Laufe der Zeit sind quantifizierbar. In vivo Fluoreszenz-Imaging-Technik wurde in erster Linie auf das Wachstum von Zellen tumorogene Spur verwendet, unsere Studie zeigt, dass es ein mächtiges Werkzeug, das uns ermöglicht, das Schicksal der transplantierten Stammzellen Weg ist.
Zellpräparation
In Vivo Imaging
Am Ende der Experimente wird die Maus getötet und das TA Muskel ist für die Histologie Analyse geerntet.
Wir haben eine zuverlässige und stabile Imaging-Plattform für die Verfolgung der fluoreszenzmarkierten transplantierten Zellen in Host Skelettmuskulatur in dieser Studie. GFP-markierten Myoblasten aus GFP transgenen Maus steht für einen Typ von adulten Stammzellen, die Kandidaten für die Zelltherapie in der Zukunft sein wird. Eine ständige Manipulation einschließlich Zellzahl, Zell-Injektion, klaren Hintergrund, Bildposition und Maschinen-Parameter ist für die Gewinnung hochwertiger Bild-und vor allem für die quantitative Analyse wichtig.
Fluoreszenz-Bildgebung hat viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung, wie sie nicht-invasiv, einfach zu bedienen ist, und hat einen hohen Durchsatz. Neben Fluoreszenz-Bildgebung kann eine quantitative Messung der Photonen, obwohl aufgrund der Streuung, Dämpfung und Absorption basiert bereitzustellen, kann Licht nicht durchdringen einen großen Abstand im Gewebe, die einen Mangel der Technik ist. Es wurden Anstrengungen im Gange, um Rot-oder Nah-Infrarot-Reporter nutzen, um die Eindringtiefe des Lichts zu erhöhen.
Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass es übersetzbar Kliniken ist, wenn die spezifischen fluoreszierenden Reporter für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist. Im Vergleich mit MRT, CT und PET, hat Fluoreszenz-Bildgebung eine hohe Flexibilität, da sie nicht teure Hardware-und Imaging-Agenten. Ein Beispiel hierfür ist Fluoreszenz-basierten Endoskop und Mikro-Endoskop, das in Kliniken verwendet wurden. Durch die Kombination von Fluoreszenz-Imaging mit anderen Modalitäten, erwarten wir die Fähigkeit, sowohl anatomische und funktionelle Informationen über die zugrunde liegenden biologischen Prozesse erwerben zu erreichen.
Die Arbeit der Z-und Y-Yang Wang wurde möglich durch Gewährung K02 AR051181 aus NIAMS / NIH, Zuschüsse aus Muscular Dystrophy Association und Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Die Arbeit von Q Zeng und X Xu sind durch ein Programm Zuschuss für das Optical Imaging Lab aus dem Brigham and Women Hospital unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Wen Liu aus der Abteilung für Anästhesie, BWH, danke für die technische Hilfe in der Zelle arbeiten.
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