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Method Article
Neurexine und Neuroligine sind Membran-Neuron Haftung Proteine, die wichtige Rollen in synaptic Differenzierung und die Übertragung durchzuführen. Neuroligin defizienten Mutanten von C. elegans Defekt sind bei der Aufdeckung von osmotischen Kraft, aber wenn sie enthalten auch eine Mutation im Gen Neurexin, erholen sie den Wildtyp-Phänotyp.
Neurexine und Neuroligine sind Zelladhäsionsmoleküle in erregenden und hemmenden Synapsen, und sie sind für die korrekte neuronales Netzwerk-Funktion 1 erforderlich. Diese Proteine sind an der präsynaptischen und postsynaptischen Membranen 2 gefunden. Studien an Mäusen zeigen, dass Neurexine und neurologins eine wesentliche Rolle in der synaptischen Übertragung 1 haben. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass einer veränderten neuronalen Verbindungen während der Entwicklung des menschlichen Nervensystems könnten die Basis für die Ätiologie der zahlreichen Fälle von Autismus-Spektrum-Störungen 3 bilden.
Caenorhabditis elegans konnte als experimentelles Werkzeug, um die Untersuchung der Funktionsweise der synaptischen Komponenten zu erleichtern verwendet werden, wegen seiner Einfachheit für Labor-Experimente, und da sein Nervensystem und synaptische Verkabelung wurde vollständig charakterisiert. In C. Elegans NRX-1 und NLG-1-Gene sind orthologen die menschliche NRXN1 und NLGN1 Gene, die alpha-Neurexin-1 und Neuroligin-1-Proteine, bzw. zu codieren. Bei Menschen und Nematoden, ist die Organisation von Neurexine und Neuroligine ähnlich in Bezug auf die funktionellen Domänen.
Der Kopf des Nematoden enthält die amphid, ein Sinnesorgan des Nematoden, die Antworten vermittelt auf verschiedene Reize, einschließlich osmotische Stärke. Die amphid ist von 12 sensorischen Neuronen bipolar mit Flimmerepithel Dendriten und ein Axon präsynaptischen Terminal 4. Zwei von diesen Neuronen, genannt ASHR und ASHL sind besonders wichtig in osmotischen sensorische Funktion, Aufdeckung wasserlösliche Repellents mit hohen osmotischen Stärke 5. Die Dendriten der beiden Neuronen an der Spitze des Mundes zu verlängern und die Axone zu verlängern, um den Nerv Ring, wo sie synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen Bestimmung der Verhaltensreaktion 6 machen.
Zur Beurteilung der Auswirkungen der Neurexin und Neuroligin in hohen osmotischen Kräfte Vermeidung, zeigen wir die verschiedenen Reaktion von C. elegans-Mutanten in NRX-1 und NLG-1-Gene, mit einer Methode auf einem 4M Fructose Ring 7 basiert. Die Verhaltens-Phänotypen wurden bestätigt mit spezifischen RNAi-Klone 8. In C. elegans, kann die dsRNA erforderlich, um RNAi auslösen durch die Fütterung 9 verabreicht werden. Die Lieferung der dsRNA durch Nahrung induziert die RNAi Interferenz des Gens von Interesse so dass die Identifizierung von genetischen Komponenten und Netzwerk-Pfade.
1: Osmotische Vermeidung Assay.
2: Generierung von Knockdown Würmer durch RNAi Fütterung.
3: Die Stämme verwendet.
Die C. elegans Stämme in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 dargestellt. Mutanten-Stämme wurden gekreuzt gegen N2 Wildtyp - mindestens vier Mal, um unerwünschte zufällige Mutationen, die während der Mutagenese Protokoll erzeugt worden sein könnten, zu entfernen.
.. OP50 E-coli-Stamm wurde von Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) mit dem Plasmid pL4440 Durchführung NRX-1 (JA: C29A12.5) suppliied und NLG-1 (JA: C40C9.5 Gen)-Fragmente wurden durch Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spanien zur Verfügung gestellt.
4: Repräsentative Ergebnisse.
Illustrative Ergebnisse sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Zehn Tiere von jedem Stamm und ein Minimum von drei Replika-Experimente wurden durchgeführt.
Abbildung 1. Experimente des osmotischen Vermeidungsverhalten.
Control-Stämme und NRX-1 (ok1649 und tm1961) V mangelhaft mutantworms durch Umkehren rückwärts, wenn sie einen osmotischen Barriere (4M Fructose) Begegnung reagieren. NLG-1 (ok259 und tm474) X-Mutanten nicht, diese Barriere zu erkennen. Doppel-Mutanten in NLG-1 und NRX-1, Stämme CRR21 (ok1649; ok259) VX und CRR23 (tm1961; ok259) VX erholte sich der Wildtyp-Phänotyp. Der * zeigt signifikante Unterschiede (P ≤ 0,001) von t-Student-Test, in der Antwort von jedem Stamm der Bristol N2 Wildtyp von t-Student-Test
Abbildung 2. Experimente mit Knockdown Würmer durch RNAi Fütterung.
E.coli HT115 (DE3) mit leeren pL4440 Vektor transformierte oder mit einem Fragment, das dem Zielgene NRX-1 oder NLG-1 wurden gefüttert anderer Wurm Stämme verwendet. Der * zeigt signifikante Unterschiede (P ≤ 0,001) von t-Student-Test, in der Reaktion des N2-Stamm mit Bakterien, die die pL4440 vector mit einem Fragment Targeting der NLG-1-Gens im Vergleich mit dem N2-Stamm mit leerem Vektor pL4440 eingespeist .
Neurexine und Neuroligine übernehmen wichtige Rollen in der synaptischen Übertragung 11 und Differenzierung von synaptischen Verbindungen 12. Beide Moleküle haben als Kandidatengene für Autismus 13,14 identifiziert worden.
In diesem Video zeigen wir eine einfache Methode, die uns um die Wirkung der Gene, die den osmotischen Vermeidung Antwort in C. Studie erlaubt elegans. Neuroligin Mutanten defekt sind bei der Aufdeckung von osmotischen...
Wir möchten dankt Herrn Dr. Antonio Miranda-Vizuete für seine wertvolle Hilfe wollen. Wir möchten auch unseren Dank an Salma Boulayoune und Isabel Caballero Ausdruck für wertvolle technische Hilfe. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Junta de Andalucía (BIO-272) finanziert. Diese Forschung wurde in Absprache mit den aktuellen Gesetzen genetische Experimente in Europa durchgeführt.
Tabelle 1. C. elegans Stämme.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Belastung | Gen | Allele | Quelle |
Bristol N2 | - | - | ÖCGK |
VC228 | NLG-1 | ok259 | CGC |
FX00474 | NLG-1 | tm474 | bNBP-JAPAN |
VC1416 | NRX-1 | ok1649 | CGC |
FX1961 | NRX-1 | tm1961 | NBP-JAPAN |
NL2099 | GebO-3 | pk1436 | CGC |
CRR21 | NRX-1; NLG-1 | ok1649; ok259 | Diese Arbeit |
CRR22 | NRX-1; NLG-1 | tm1961; ok259 | Diese Arbeit |
a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA.
b. Nationale Bioresource Projekt für das Experimental Animal "Nematoden C. elegans". Tokyo Womens Medical University, Japan.
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