Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Zusammenfassung

Verfahren zur Düngung Xenopus Oozyten Durch den Host Übertragungsmethode.

Zusammenfassung

Studium der Beitrag der mütterlich vererbten Moleküle frühen Entwicklung Wirbeltieren wird häufig durch die Zeit-und Kostenaufwand notwendig, Mutter-Effekt mutierten Tiere erzeugen behindert. Darüber hinaus werden viele der Techniken zur Überexpression oder Hemmung der Genfunktion in Organismen wie Xenopus und Zebrafisch ausreichend Ziel kritische mütterlichen Signalwege wie Wnt-Signalweg. In Xenopus, kann die Manipulation der Genfunktion in kultivierten Eizellen und anschließend düngen sie diese Probleme zu einem gewissen Grad zu mildern. Die Eizellen werden manuell vom Spender Eierstockgewebe defolliculated, injiziert oder behandelt in der Kultur, wie gewünscht, und dann mit Progesteron stimuliert die Reifung zu induzieren. Anschließend werden die Eizellen in die Körperhöhle ein Eisprung Host weiblichen Frosch eingeführt, worauf sie durch den Host-Eileiter transloziert werden und erwerben Modifikationen und Gelee Mäntel, die für die Befruchtung. Die resultierenden Embryonen können dann auf die gewünschte Stufe angehoben werden und analysiert die Auswirkungen der experimentellen Störungen. Diese Host-Transfer-Verfahren wurde sehr effektiv bei der Aufdeckung von grundlegenden Mechanismen der frühen Entwicklungsphase und ermöglicht eine breite Palette von experimentellen Möglichkeiten nicht in jedem anderen Wirbeltieren Modell-Organismus.

Protokoll

1. Chirurgische Entfernung von Eierstockgewebe

1. Bereiten Sie eine neue Charge der Eizelle Kulturmedium (OCM; Materials), zwischen 400-800 ml, je nach Größe des Experiments. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6-7,8, bis die Phenolrot wird eine dunkelrote Farbe (sechs oder so kleine Tropfen von 5N NaOH). Gieße eine kleine Menge auf den pH-Wert in einem separaten Röhrchen zu überprüfen, da der pH-Elektrode den Medien verunreinigen können. OCM sollte bei 18 ° C gelagert werden und innerhalb von einer Woche.
2. Wählen Sie 3-5 Weibchen und Platz eins in ~ 2L gepuffert Anästhesielösung (Materials). Wir versuchen zu vermeiden, mit Fröschen, die am Tag der oder vor der Operation zugeführt wurden. Während der Frosch auf die Narkose verfallen ist, desinfizieren Sie die OP-Bereich mit 70% EtOH und bereiten die chirurgischen Instrumente.
3. Sterilisation der chirurgischen Instrumente, die von 20-Sekunden Eintauchen in eine heiße Perle Sterilisator bei 250 ° C. Die folgenden Instrumente sollten zur Hand sein: Skalpellgriff (# 3) und Klinge (# 10 oder 11), mehrere Paare von Dumont Pinzetten, Bonn Iris Schere (gebogene oder gerade), Halsey und Olsen-Hegar Mikro Nadelhalter und Nahtmaterial. Legen Sie sterilisierten Instrumente auf einer sterilen Petrischale oder auf der Innenseite der Naht-Paket zu halten steril. Fassen Sie die Nadel in den Nadelhalter in der gewünschten Orientierung vor Beginn. Wir bevorzugen Olsen-Hegar Nadelhalter seit den Griff enthält Scherenblätter, die verwendet werden, um Nähte ohne Umschalten Instrumente trimmen können.
4. Nach 10 Minuten prüfen, ob ein chirurgischer Ebene der Anästhesie erreicht wurde. Narkotisierten Fröschen wird nicht mehr bewegen und nicht an einer Zehe Prise reagieren oder sich umgedreht. Anästhesie sollte letzten 15 Minuten, was mehr als genug Zeit, um die Operationen durchzuführen. Don geeignete chirurgische Kleidung. Dazu können auch saubere Handschuhe (non-latex), Kittel und OP-Masken, je nach persönlicher Vorliebe und institutionelle Tierpflege Richtlinien.
5. Hinweis zur aseptischen Bedingungen: Frog Hautabsonderungen enthalten antimikrobielle Peptide, die im Allgemeinen Verringerung der Inzidenz von Kontamination während der Operation, obwohl aseptischen Bedingungen so weit wie möglich befolgt werden sollten. Operationsabdecktücher kann verwendet werden, dürfen aber nicht durch institutionelle IACUCs erforderlich sein und dürfen nicht bieten viel profitieren. Generell "Spitze-Technik" eingesetzt, wo die Hände der sterilen Spitzen der Instrumente, Nahtmaterial oder Inzisionsstelle berühren. Instrumente können resterilisiert (in der Perle Sterilisator) werden folgende Inzision der Haut und einer sterilen Bereich sollte auf dem Labortisch für die Platzierung Instrumente (wie eine Petrischale oder Naht-Paket) beibehalten werden. Institutionelle Anforderungen können erheblich abweichen, so folgen Sie bitte Ihre Institutionen Richtlinien und eine angemessene Unterweisung vor der Durchführung Operationen.
6. Entfernen Sie den Frosch aus Anästhesie und in Rückenlage auf einer feuchten chirurgischer wischen. Hinweis. Die Haut kann durch Spülen in verdünnter Povidin Jod (1:20) oder Chlorhexidin (0,75%) gereinigt werden. Vermeiden Sie jedoch kommerziellen chirurgischen Peelings, Seifen und 70% Isopropylalkohol, da diese die empfindliche Haut der Amphibien führen.
7. Mit einem Skalpell oder kleine Iris Schere, einen kleinen (1 bis 1,5 cm) Schnitt in der Haut im unteren Teil des Bauches, lateral der Mittellinie. Nachfolgende Einschnitte auf dem gleichen Frosch wechselseitig durchgeführt werden sollte, gut voneinander entfernt. Einschnitte können entweder parallel oder senkrecht zur Mittellinie erfolgen.
8. Nehmen Sie die Haut und Bauchmuskeln Einschnitte in zwei Stufen. Nach dem Schneiden der Haut, heben Sie die Muskelschicht und Umgebung weiß gefärbte Faszie mit einer Pinzette und machen den Schnitt in der erhöhten Muskel. Mit einer Schere und schnitt gerade nach unten, versuchen, mit einer schnellen Schnitt in die Leibeshöhle verlassen saubere Wundränder aussetzen. Wenn nur die Faszie geschnitten wird, wird es zurückgezogen und macht Nähen schwieriger. Lifting der Muskel hilft nicht versehentlich verletzt keine inneren Organe. Versuchen Sie auch, zu vermeiden Schneiden durch sichtbare Lymphherzen oder Blutgefäße innerhalb der Muskelschichten. Verlängern Sie die Länge mit der Schere des Schnittes, so dass Eierstock leicht herausgezogen kann durch sein.
9. Eierstock muss deutlich sichtbar sein, wenn der Schnitt gemacht. Zu beschaffen Eierstock, mit einer Pinzette fassen und externalisieren die Eierstockgewebe. Die gewünschte Menge an Gewebe entfernt ist, und getrimmt off auf der Ebene des Körpers Wand. Nicht Zeug das Gewebe wieder in die zölomischen Hohlraum, da dies eine Quelle der Infektion oder andere Komplikationen auftreten könnten.
10. Unmittelbar beobachten ein kleines Stück Eierstock unter einem Binokular und defolliculate ein paar Eizellen, um ihre Qualität zu testen. Sie sollten fest sein und eine einheitliche Größe und Färbung. Wenn sie akzeptabel sind, entfernen Sie die gewünschte Menge Eierstockgewebe und Naht des Schnittes. Genug, um eine 90 mm Petrischale füllen ist in der Regel ausreichend für die meisten Experimente. Wenn die Eizellen von fragwürdiger Qualität sind, Naht der Frosch, und wiederholen Sie mit einer anderen Frau.
11. Schließen Sie den Schnitt durch Naht der Muskeln und Faszien Schicht zuerst. Legen Sie die n eedle wenige Millimeter lateral der Inzision, achten Sie darauf, durch die Faszie Schicht als auch weitergeben. Nahtmaterial nur durch den Muskel reißen das Gewebe und lösen kann. Verwenden einer Pinzette, um die Nadel von unten auf der gegenüberliegenden Seite des Schnittes. Release and re-fassen die Nadel von außerhalb des Körpers und ziehen Sie den Faden durch, bis mehrere Zentimeter oder so der Schwanz bleibt, kümmert sich nicht um ziehen Sie den ganzen Weg durch.
12. Schließen Sie die Wunde mit einem einfachen unterbrochen Muster der Naht. Wir verwenden ein grundlegendes Instrument Bindung an Chirurgen quadratischen Knoten (Riff Knoten) zu machen. Schleife das lange Ende des Fadens um den Nadelhalter, fassen Sie den Schwanz und ziehen Sie es durch die Schlaufe in Richtung zu Ihnen und zu straffen. Loop und ziehen wieder durch, ziehen Sie dieses Mal den Nadelhalter von Ihnen entfernt. Eine dritte werfen kann für zusätzliche Sicherheit verwendet werden (in die gleiche Richtung wie die erste). Schneiden Sie die Naht, so dass kurze Schwanz und das andere tun Naht in den Muskel ein paar Millimeter entfernt. Zwei Nähte sind ausreichend für kleine Nähte, drei für größere. Wiederholen Sie dies für die Hautschicht. Video-Demonstrationen von grundlegenden Nahttechnik sind auf YouTube - Suche nach "Instrument tie", es gibt durchaus ein paar zur Auswahl, obwohl die grundlegende Technik ist die gleiche.
13. Spülen Sie das Weibchen mit deionisiertem Wasser und legen sie in eine Erholung Eimer mit kaltem (18 ° C) Wasser gefüllt. Während im Labor, sind die Frösche in Leitungswasser mit Amquel behandelt, um Chloramine zu entfernen gehalten. Alle paar Minuten, heben den Frosch aus dem Wasser und suchen Sie schlucken oder ins Auge prall Bewegungen, was auf aus der Narkose.
14. Hinweis: Survival Chirurgie ist nicht unbedingt notwendig, Eierstockgewebe erhalten, obwohl die Weibchen weiterhin gute Eizellen nach einer Reihe von Operationen zu erzeugen. Performing Überleben der Operation wird auch reduzieren auf die Anzahl von Tieren verwendet wird. Achten Sie darauf, Ihr Tier kümmern Einheit Richtlinien an Wirbeltieren Überleben Operationsmethoden, post-op Pflege und Überwachung und für die Anzahl der erlaubten Operationen auf einem einzelnen zu folgen.

2. Anzucht und Defolliculating Oozyten

1. Gleich nach der Operation beendet ist, unterteilen den Eierstock in kleine Stücke schneiden (ca. 2 cm ²⁾ und speichern in frischen OCM mit 5-6 Stück pro 90 mm ​​Schale. Einzelne Lappen des Eierstocks sind aufgeschnitten, flach ausgeschnitten und in quadratische Stücke. Diese sind in sauberen OCM gespült und in Gerichten für die Kultur. Abflachung und die Aufteilung des Eierstocks wird sein Leben in der Kultur zu erweitern und zu defolliculation einfacher.
2. Verschieben eines Lappens in eine kleine Schale der OCM und manuell defolliculate 300-500 Oozyten. Transfer-Oozyten mit einer sterilen, feuerpolierte Pipette. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung der Baumwolle gesteckt Vielfalt ist wichtig für die Minimierung Kontamination der Kulturen. Bewahren Sie die Oozyten bei 18 ° C in 8 mL OCM (in mittlerer Gerichte (Falcon 1007)) in Gruppen von 100-150. Mit etwas Übung sollte es möglich sein, genügend Eizellen in 1-2 Stunden defolliculate. Collagenased Eizellen sind nicht geeignet für Host übertragen, da sie nicht befruchtet werden.
3. Defolliculating Methode. Wir defolliculate mit Uhrmacher Pinzetten (Dumont # 4s oder # 5s, Fine Science Tools), im Anschluss an die grundlegenden Methoden in Smith et al. Beschrieben, (1991). Mit einem Pinzette (in Ihrer dominanten Hand), fassen Sie die Theca Bindegewebsschicht um einen ausgewachsenen Stadium VI Oozyten in der Nähe, wo die Follikel der Ovarien (der Stiel) befestigt. Mit der anderen Pinzette fassen Sie den Eierstock benachbart zu dem ersten Paar. Leicht Aufreißen der Follikel-Schicht, indem Sie über die Eizelle. Gently necken die Eizelle aus dem Gewebe. Erfolgreich defolliculated Eizellen floppier als Eizellen einfach abgezogen, ohne die Follikel Schicht und wird frei von sichtbaren Blutgefäße.
4. Hinweis: Es ist wichtig, sehr leichten Druck auf die Spitzen der Pinzette zu halten, kaum genug für die Tipps zu erfüllen. Greifen zu eng ist eine häufige bei Anfängern und wird in die Eizelle weggezogen mit dem Follikel intakt führen. Halten Sie eine gute Pinzette ausschließlich für defolliculating. Die Spitzen sollten exakt erfüllen und sollte etwas stumpfer als Zange zur Herstellung von Explantaten aus Xenopus Embryonen (Abbildung 1).
5. Wir routinemäßig über 20 mit Progesteron und Abbruch des Experiments reifen, wenn die Reifung ist noch niedrig (<50% nach 6-7 Stunden bei Raumtemperatur).
6. An diesem Punkt können die Eizellen manipuliert werden und kultiviert wie gewünscht, wie Mikroinjektion von Oligo-, Morpholino-oder mRNA. Injection Verfahren variieren je Lab, so werden wir nicht beschreiben, den Sie hier. Eizellen können bis zu einer Woche in OCM beibehalten werden, aber im Allgemeinen die Gesundheit sinkt so ist es am besten, um sie für die Übertragung innerhalb von 96 Stunden der Isolation zu verwenden.
7. Beachten Sie, dass nur fünf bis sechs Gruppen (einschließlich einer Kontrolle), um ein einziges Weibchen übertragen werden können, aufgrund der Beschränkungen, die Vitalfarbstoffen, so planen Sie Ihre Experimente entsprechend.

"> 3. Eizellreifung und Stimulation der vorgesehenen Gastgeber Frauen

1. Wenn der Durchführung einer Rettung von Oligo Erschöpfung, Injizieren Sie Ihr mRNA (in der Regel 50-300 pg RNA) ~ 24-48 Stunden nach der Oligo. Die Oligos werden abgebaut durch diese Zeit und sollte keinen Einfluss auf die injizierten RNA.
2. Am Abend vor der Durchführung der Übertragung werden 16 ul von Progesteron-Arbeitslösung (1 mM in EtOH) auf Eizellen in 8 mL OCM in mittel-Gerichte (final Progesteron-Konzentration ist ~ 2 pM). Inkubieren 10-12 Stunden bei 18 ° C für Eizellreifung zu ermöglichen.
3. Inject 3-5 Weibchen mit 1000 Einheiten pro Frosch von hCG zur Eiablage zu induzieren. Unsere Versuche scheinen besser zu funktionieren, wenn Eizellreifung und hCG-Injektion etwa zur gleichen Zeit fertig sind, etwa 12 Stunden vor der Implantation in den Wirt (zB 10.00 Uhr -10 Uhr). Lassen Frauen bei RT oder 18 ° C über Nacht.

4. Vorbereitung und Vital Dye Färben von Eizellen

1. Am Morgen des Transfers erlauben ~ 45-60 "einzurichten und zu führen Sie das Verfahren. An dieser Stelle können reife Eizellen für eine spätere Analyse der Wirksamkeit von mRNA Zuschlag oder Protein-Expression eingefroren werden. Überprüfen Sie auch, dass die Eizellen noch nicht infiziert werden und dass es eine gute Reifung (> 50%). Infizierte Eizellen nicht befruchtet. Thaw Vitalfarbstoffen (Materials) und Spin bei max Geschwindigkeit für 5 min.
2. Farbe der verschiedenen experimentellen Gruppen durch Zugabe von 80 ul der entsprechenden Vitalfarbstoffs (s) zur Eizelle Gerichte und inkubieren mit Schaukeln für 15 '. Während dieser Zeit, wählen Sie einen Host weiblichen und beginnen Anästhesie. Wählen Sie einen Frosch, der sich langsam Verlegung Eier in der Regel oder eine, die reichlich Eier mit leichten Zusammendrücken produziert. Eier aus dem Host sollte von guter Qualität sein. Vermeiden Sie, dass Frauen über Strings von Eiern oder zerkleinert Eier sind.
3. Übertragen Sie die bunten Eier, eine große Schale mit frischen OCM, schwenken kurz zu waschen und legen Sie sie beiseite vor der Übertragung.
4. Bereiten Sie eine sterile Pasteurpipette mit einer Bohrung gerade breit genug, um eine Eizelle (~ 1,5 mm) für den Einsatz bei der Transplantation von den Eizellen unterzubringen. Ergebnis der Pipette mit einem Diamanten und Bleistift Pause sauber. Feuer polieren, bis die Kanten glatt sind, dabei nicht zu schmelzen die Öffnung geschlossen.

5. Durchführen der Oocyte Transplantation

1. Oocyte Transplantation verwendet die gleichen Operationen wie in Teil I beschrieben, obwohl anstatt sie zu entfernen Eierstock, manipuliert Eizellen in die Körperhöhle mit einer Pipette eingeführt werden. Idealerweise sollte der Transfer Verfahren so rasch wie möglich durchgeführt werden und die Größe der Inzision sollte so klein wie möglich gehalten werden.
2. Anesthesize den Host weiblichen und bereiten chirurgische Instrumente, wie in Teil I beschriebenen Stellen und Anschneiden der Beschreibung in Teil I. Der Schnitt kleiner sein kann, muss aber groß genug sein, um die Bohrung des Transferpipette (Abbildung 2A) passen.
3. Um Transplantation der Eizellen, fassen und heben einer Klappe von Muskeln und Faszien mit einer Pinzette und die Einführung der experimentellen Oozyten mit der Pasteurpipette oben hergestellt. Swirl das Gericht von Eizellen, um sie in der Mitte sammeln und saugen so viele wie möglich. Lassen Sie die Eizellen in den Ende der Pipette niederlassen, um überschüssige Flüssigkeit entfernt, gebracht werden und legen Sie die Spitze der Pipette in den Schnitt und langsam damit die Eizellen in den Körper Hohlraum (Abbildung 2B) rieseln. Wiederholen, bis alle Eizellen übertragen wurden. Nicht loslassen der Muskelschicht zu jeder Zeit, bis man begonnen Naht haben, oder die Eizellen werden austreten des Einschnitts.
4. Sobald die Eizellen übertragen wurden, erfassen beide Seiten des Schnittes mit einer Pinzette und bringt sie zusammen, so dass die Eizellen in die Körperhöhle zu begleichen. Begin Nähen wie beschrieben, wobei darauf zu achten aufwärts Spannung auf die Muskeln und Faszien zu halten, bis der erste Knoten gebunden ist (Abbildung 2C). Dies wird die Eizellen die Ausstoßung aus zu halten und ermöglicht die Kanten des Schnittes gleichmäßig zu heilen. Add another Naht in den Muskel / Faszien Schicht und dann Naht der Haut.
5. Spülen Sie das Weibchen mit deionisiertem Wasser und legen sie in eine Erholung Eimer mit gekühlten (18 ° C) Amquel-behandeltem Wasser gefüllt. Überwachen sie aus der Narkose wie oben. Sie sollten beginnen, Eier zu legen in der Regel nach der Operation.
6. Erhalten Hoden eines männlichen Frosches nach den üblichen Verfahren. Bewahren Sie die Hoden in OCM oder L15 bis es gebraucht wird. Wir bevorzugen frische Hoden beim Düngen Transfer-Experimenten.

6. Rückgewinnung von Oozyten und in vitro-Fertilisation

1. Peritoneal Flimmerhärchen wird die übertragene Eier (und normale zölomischen Eier des Wirtes), um die Öffnungen der Eileiter in die vordere der Körperhöhle zu fahren. Bunte Eier können wiederhergestellt Beginn 2-3 Stunden nach dem Transfer von normalen Quetschen werden. Eier können jede halbe Stunde oder so gewonnen werden, bis das Weibchen nicht mehr über.
2. Düngen Sie in einer sperm Suspension (in ca. 4 mL 1x MMR) für 4 Minuten. Flood und spülen Sie ausgiebig mit 0.1x MMR. Eier sollten in der Regel zu aktivieren und zu spalten ~ 1,5-2 Stunden nach der Befruchtung beginnen. Übertragen Eier werden oft spalten etwas später als der Host Eier.
3. Entfernen Sie das Gelee Mäntel mit Cystein als normal und Art Embryonen in separate Küche. Dies kann zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, je nach den Bedürfnissen des Experiments. In der Regel am einfachsten, die verschiedenen Farben um den 4-Zellen-Stadium und schwierigsten während der späten Blastula Stadium zu erkennen. Kultur die Eier bei einer geringen Dichte (<50 pro Medium Gericht) in saubere 0.1x MMR. Ab diesem Zeitpunkt können Embryonen behandelt und manipuliert werden in der Regel.
4. Bringen Sie die Frösche, die Tierhaltung und Monitor für Komplikationen während der nächsten paar Tage.
5. Alternate Befruchtung Methode; Eiablage in Hochsalzpuffer
   1. Nach dem Frosch aus der Narkose erholt hat, statt sie in ~ 1L hohem Salzgehalt MMR (1,2 x). Lassen Sie das weibliche Eier in den Puffer legen für ca. 4-6 Stunden. Squeeze restlichen Eier aus, abtropfen lassen 1.2x MMR und sortieren gefärbte Eier in saubere Schüssel; entfernen Sie alle möglichen Flüssigkeit.
   2. Wash ausgiebig mit 0,3 x MMR und düngen in minimalen Volumen von 0,3 x MMR / Spermiensuspension bis Eiern (10 Minuten) zu aktivieren. Flood mit 0.1x MMR und Kultur wie oben. Diese Option ist nützlich, wenn viele Eier auf der gleichen Stufe oder wenn manuelle Ausdruck von Eiern Schäden des Spenders Eizellen benötigt werden.

Diskussion

Die erfolgreiche Übertragung wird bei der Befruchtung und normale Spaltung von> 50% der Oozyten (Abbildung 3) führen. In der Regel zwischen 30-60% der transferierten Eizellen wird über die Neurula Stadien überleben. Wir in der Regel übertragen 75-150 Eizellen pro Versuchsgruppe, die genügend Embryonen für verschiedene Arten von Analyse Ausbeute (in situ, RT-PCR) sowie die Visualisierung der Phänotyp. Die Implantation wesentlich mehr Eizellen scheint nicht zu einer deutlichen Steigerung der Rendite. Außerdem ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Leibovitz L-15-Medium (mit L-Glutamin)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penicillin-Streptomycin	(Sigma P-0781)
Passen Sie auf pH 7,6-7,8 mit 5N NaOH
Machen Sie frische wöchentlich, Lagerung bei 18 ° C.

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl 2

10 mM MgCl 2

150 mM HEPES

auf pH 7,6-7,8

Lagerung bei 4 ° C

1 g / L 3-Aminobenzoesäure-ethylester (MS222)	(Sigma A-5040)
0,7 g / L Natriumbikarbonat
Man löst in Amquel-behandeltem Wasser
Machen Sie frische wöchentlich

10 mM Progesteron (Sigma P-0130) in 100% Ethanol

Verdünnen auf 1 mM in 100% EtOH für eine 500x Lager / funktionierende Lösung

Lagerung bei -20 ° C

Blue: 0,1% Nilblau A	(Aldrich 121479-5G)
Red: 0,25% Neutral Red	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Grün (80 ul blau + 80 ul braun),
Mauve (80 ul blau + 80 ul rot).
Eine sechste Farbe, Orange (80 ul rot + 80 ul braun), kann auch verwendet werden, ist aber oft nur schwer von braun zu unterscheiden.