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Method Article
Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Neuritenwachstum und Bildgebung von Calcium-Spiegel mit Fura-2.
In diesem Video zeigen wir die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Das Verfahren beginnt mit der Entfernung der Gehirne von Tieren, bei 70-78 Std. nach Puparium Bildung. Die isolierte Gehirne sind nach kurzer Inkubationszeit in Papain von mehreren Wäschen in serumfreien Wachstumsmedium gefolgt gezeigt. Der Prozess der mechanischen Dissoziation jedes Gehirn in einem 5-ul Tropfen Medien auf einem Deckglas dargestellt. Die Axone und Dendriten der post-mitotischen Neuronen off in der Nähe des Soma während Dissoziation sheered aber die Neuronen beginnen, um Prozesse innerhalb von wenigen Stunden plating regenerieren. Bilder zeigen, lebende Kulturen in 2 Tagen. Neuronen weiterhin Prozesse während der ersten Woche in Kultur zu erarbeiten. Speziellen neuronalen Populationen können in Kultur identifiziert werden mit GAL4 Linien gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Markern wie GFP oder RFP-Laufwerk. Ganzzell-Aufnahmen haben gezeigt, den kultivierten Neuronen bilden funktionelle, spontan aktive cholinergen und GABAergen Synapsen. Ein kurzes Video Segment zeigt Calcium-Dynamik in der kultivierten Neuronen mit Fura-2 als Kalzium-Indikator-Farbstoff zu spontanen Kalzium Transienten und Nikotin hervorgerufenen Calcium-Reaktionen in eine Schüssel mit kultivierten Neuronen zu überwachen. Diese Puppen Gehirn Kulturen sind ein nützliches Modell, bei dem genetische und pharmakologische Werkzeuge zur inneren und äußeren Faktoren, die Bildung und Funktion von zentralen Synapsen beeinflussen identifiziert werden können.
Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung:
Am Tag der Kultivierung
I. Vorbereitung Enzymlösung (ES) in Laminarströmungshaube
II. Machen DDM2 Medien
Am Tag der Kultivierung: fügen Sie die folgenden Ergänzungen zu machen DDM2
Zu 10 ml DMEM fügen Sie die Ergänzungen, kurz vor Kultivierung:
Hinweis: Achten Sie genug DDM2 für alle Kulturen geplant (jedes Gehirn auf einem einzigen Deckglas in eine individuelle 35 mm Petrischale, 1,5 ms der Medien / Kultur verchromt)
Step III-VI kann mit einer nicht sterilen getan Labortisch und sollte in 45 Minuten oder weniger abgeschlossen sein.
III. Puppen-Sammlung
Hinweis: Wir verwenden in der Regel Gehirn aus Puppen zwischen 55-78 Stunden nach Puparium Bildung (APF). Es ist etwas schwieriger zu sezieren das Hirn aus der jüngeren Puppen da der Kopf Kapseln zum Einsturz neigen, während das gesamte Niveau der Neuritenwachstum ist etwas geringer aus dem ältesten Puppen. In der Canton-S Wildtypstamm, werden diese Phasen durch pigmentierte Augen, hellbraune bis leicht rötlich anerkannt sind, mit wenig Pigment anderswo.
IV. Enthauptung unter Präpariermikroskop
V. Entfernung des Gehirns von Kopf unter Präpariermikroskop
VI. Entfernung von Sehlappen und Enzymbehandlung
Innerhalb sterile Laminarströmungshaube - alle Schritte, bei denen Gewebe der Luft ausgesetzt ist, sollte in Laminarströmungshaube für die verbleibenden Schritte getan werden.
VII. Waschen
VIII. Trituration und Plating unter Präpariermikroskop
IX. Feeding Cells
Neuronen aus dem Gehirn von embryonalen / postnatale Nagetiere geerntet werden in primären Zellkulturen gezüchtet werden, wo sie Neuriten und erweitern Form funktioneller synaptischer Verbindungen. Methoden zur Herstellung dieser Kulturen sind gut etabliert und Studien in Nagetieren neuronalen Kulturen haben eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Genen und Umweltfaktoren bei der Regulierung der Synapsenbildung und Funktion (Banker und Goslin, 1991) beteiligt gespielt. Während Insekten Neuronen aus einer Vielzahl von Arten k...
Diese Arbeit wurde vom NIH NS27501 zu DKOD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeiten wurde durch ein Stipendium, um UC Irvine zur Unterstützung der DKOD durch die HHMI Professor Programm zur Verfügung gestellt.
Coating Deckgläser: Put autoklaviert Deckgläschen in einer 60 mm Petrischale. Pipettieren Sie 5 ul der Con A / Laminin-Mix auf Mitte jedes Deckglas. Legen Sie in 37 C Inkubator für 2 Stunden. Spülen Sie 3x Deckgläschen mit 100 ul autoklaviert Wasser jeden. Verwenden Sie einen Staubsauger an einer sterilen Pasteur-Pipette. Während der letzten Spülgang, nehmen Sie den Deckglas mit einer Pinzette und trocken beiden Seiten. Übertragen Sie die Deckglas zu einer 35-mm-Petrischale. Lagerung bei Raumtemperatur für bis zu einem Monat.
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