Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

Zusammenfassung

In diesem Video zeigt Nijole Jasinskiene der angewandten Methode, um transgene Aedes aegypti Mücken, die Überträger für Dengue-Fieber sind zu generieren. Die Techniken für die richtige Vorbereitung Mikroinjektion Nadeln, Entfeuchtungsmittel Embryonen, und die Durchführung der Mikroinjektion werden aufgezeigt.

Zusammenfassung

In diesem Video zeigt Nijole Jasinskiene der angewandten Methode, um transgene Aedes aegypti Mücken, die Überträger für Dengue-Fieber sind zu generieren. Die Techniken für die richtige Vorbereitung Mikroinjektion Nadeln, Entfeuchtungsmittel Embryonen, und die Durchführung der Mikroinjektion werden aufgezeigt.

Protokoll

Vorbereitung im Vorfeld der Mikroinjektion

1. Blut ernähren Mücken: für die Injektion von Montag bis Freitag Feed Weibchen auf der vorigen Donnerstag.
2. Bereiten Glasnadeln mit dem Programm 3 oder 2 (siehe Materialien).
3. Legen Rohr für die Embryonen Drosophila Kultur Durchstechflasche. Wet Watte in den Boden, mit einem nassen Scheibe Filterpapier für sie.
4. Bereiten Kunststoff Deckglas durch Kleben beidseitig Klebeband an einem Ende. Trim Band Deckglas, so dass es am Rande des Deckglases endet.
5. Bereiten Öl für Austrocknung (siehe Materialien)
6. 150 ml Kunststoffbecher mit einem feuchten Wattebausch in den Boden, mit einem nassen Scheibe Filterpapier (Whatman 80mm) abgedeckt, um Embryonen nach der Injektion zu halten.

Set up der erzwungenen Verlegung

1. Sammeln 6-10 Blut zugeführt Weibchen mit dem Einsatz von einem Aspirator und übergeben sie an die Drosophila Kultur Fläschchen mit nassen Baumwolle und Filterpapier.
2. Legen Sie die Moskitos wieder in Insektarium Bedingungen in der Dunkelheit, und lassen Sie Eier für 1h und 15 Minuten lag.
3. Lassen Erwachsenen in den Käfig zu fliegen, und entfernen Sie das Filterpapier Festplatte mit Embryonen.
4. Um line up Eier, tun Sie dies unter Binokular. Mit feinen Pinzetten Nr. 5 oder einem feinen Pinsel, Pick grau bis schwärzlich-grau Embryonen und ordnen Linie auf Platz 3MM Whatman-Papier mit Wasser getränkt. Alle Embryonen müssen in der gleichen Orientierung, wie Injektion muss am hinteren Pol sein. Das vordere Ende des Embryo ist etwas breiter als die hinteren. Dry das Filterpapier mit Embryonen, indem trockenes Filterpapier, um es (wet Dinge werden nicht auf Band-Stick). Um die Eier zu übertragen, drehen Sie die Folie mit dem doppelseitigen Klebeband und sanft gegen die Eier zu drücken. Das hintere Ende der Eier müssen sehr nah an den Rand des doppelseitigem Klebeband.
5. Trocknet die Embryonen ca. 1 min. bei Raumtemperatur. Sie fangen an, etwas Grübchen, wie sie trocken.
6. Abdeckung ausgetrocknet Embryonen mit Halocarbonöl weitere Austrocknung zu verhindern.

Mikroinjektion der Embryonen

1. Der wichtigste Aspekt guter Injektion wird die Qualität der Nadel (siehe Materialien).
2. Füllen Sie eine Nadel mit der DNA-Lösung, um mit Hilfe eines Microloader injiziert werden. Sehr wenig Injektionslösung wird benötigt: 1 bis 2 ul.
3. Schließen Sie die Nadel auf die Transjector, die Einspritzzeit (Manu) und Druck (600) steuert, und der Gegendruck (250). Mikroinjektion wird mit einem Mikroskop mit einer beweglichen Bühne (Leica) bei 10facher Vergrößerung und Mikromanipulator. Falls erforderlich, kann eine erhöhte Mikroskoptisch durch Stapeln 05.04 Objektträger vorzubereiten. Legen Sie das Deckglas tragen die Embryonen auf die erhöhte Bühne. Inject Embryonen horizontal zu verhindern Reißen der endochorion; Penetration sollte am hinteren Pol sein. Für die Injektion, halte ich die Nadel stationär und bewegen die Bühne des Mikroskops.
4. Inject 0,2-0,5 nl der Lösung, entsprechend etwa 1-5% des Embryos Volumen. Kontrollieren Sie die Einspritzmenge durch Anpassung der Einspritzdruck und Zeit. Die leicht gebeugt, ausgetrocknete Embryonen sollten wieder ihre schwülstige Erscheinung nach der Injektion.
5. Pick-Embryonen aus dem Deckglas mit feinen Pinzette oder einem feinen Pinsel, und legen Sie sie in einen Plastikbecher mit nassen Baumwolle und feuchtem Filterpapier. Deckel Becher mit Seidenpapier. Keep in Ort mit Gummiband um den Rand und zum Insektarium Bedingungen für 4 Tage.

Post-Injektion

1. Vier Tage nach sorgfältig Platz Embryo Papier, embryo-Seite nach unten auf dem Wasser in großen Plastik-Box mit einer kleinen Menge von Lebensmitteln. Embryonen Luke über einen sehr langen Zeitraum: nicht werfen die Kultur bis mindestens 4-5 Wochen nach der Injektion.

Hinweise

DNA für die Injektion

Plasmid-DNA-Lösung zur Injektion wurde unter Verwendung Endofree Plasmid-Kit. Konstruieren und Helferplasmids vermischen sich in richtigen Konzentration, fällt mit izopropanol. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol, bevor Resuspendieren in Injektionspuffer gewaschen. Vor der Injektion, saubere DNA mit Millex-GV-Spalte.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape