Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Zusammenfassung

Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.

Zusammenfassung

Die meisten HIV-responsive Expressionsvektoren sind die HIV-Promotor, die long terminal repeat (LTR) basiert. Während in Reaktion auf eine frühe HIV-Protein, Tat, ist der LTR reagiert auch auf zelluläre Aktivierung Staaten und den lokalen Chromatin, in denen die Integration stattgefunden hat. Dies kann in hohen HIV-selbständigen Tätigkeit ergeben, und hat beschränkt die Nützlichkeit von LTR-based-Reporter zu markieren HIV-positive Zellen ^1,2,3. Hier bauten wir einen Ausdruck lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR, zahlreiche HIV DNA-Sequenzen, die Rev-Response-Element und HIV-Spleißstellen ^4,5,6 gehören. Der Vektor wurde in einem lentiviralen Reporter Virus eingebaut, ermöglicht hochspezifischen Nachweis der Replikation von HIV in lebenden Zell-Populationen. Die Aktivität des Vektors wurde durch die Expression des grün fluoreszierendes Protein (GFP) gemessen. Die Anwendung dieses Vektors wie hier berichtet bietet eine neuartige Alternative Ansatz, bestehende Methoden wie in-situ-PCR oder HIV-Antigen-Färbung, um HIV-positive Zellen zu identifizieren. Der Vektor kann auch Ausdruck therapeutische Gene für Grundlagen-oder klinischen Versuche zur HIV-positive Zielzellen.

Protokoll

1. Die Transfektion von Plasmiden für die Produktion von Rev-abhängige Lentivirale Partikel

Set up: Die Rev-abhängige GFP lentiviralen Vektor, PNL-GFP-RRE-SA, war zuvor ^4,5,6 beschrieben. Zur Montage in einen viralen Partikel wurde das Plasmid in HEK293-Zellen mit einer HIV-1-Verpackung zu konstruieren, pCMVΔ8.2 (freundlicherweise von Dr. Dider Trono zur Verfügung gestellt) contransfected und ein Plasmid, das VSV-G-Glykoprotein (pHCMV-G) . Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt.

Herstellung der Puffer: 10 X HBS (HEPES-gepufferte Saline) wurde durch Auflösen von 5 g Hepes vorbereitet, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g Dextrose, 0,103 g Na ₂ HPO ₄ (wasserfrei) in 100 ml H ₂ O. Aliquot Die10 X HBS-Puffer in 1 mL Aliquots und bei -20 ° C. Zum Zeitpunkt der Transfektion, konvertieren Sie die 10 X HBS bis 2 X HBS mit H ₂ O (1: 5 Verdünnung) und den pH-Wert zwischen 7,05 bis 7,12. (Für 10 mL 2 X HBS, es erfordert in der Regel etwa 50 ul 1M NaOH). Filter sterilisieren 2X HBS-Puffer, indem sie durch ein 0,22 um Millipore-Filter. CaCl _2-Puffer wurde durch Lösen von CaCl ₂ in 10 mM Hepes, um eine Endkonzentration 2M gemacht. Der pH-Wert auf 5,8, Filter sterilisieren Puffer und lagern bei 4 ° C.

Vorgehensweise:

1. Einen Tag vor der Transfektion, Samen 2 x 10 ⁶ HEK293T Zellen in einer 100 mm Petri-Schale, und wachsen Zellen über Nacht in 10 mL DMEM + 10% FBS bei 37 ° C, 5% CO _2.
2. Am nächsten Tag entfernen Überstand von Zellen und ersetzen mit 5 ml frisches DMEM + 10% FBS, kontinuierlich Kultur-Zellen für 4 Stunden.
3. In einer 5-ml Polystyrol Röhrchen, fügen Sie 480 ul 2X HBS-Puffer.
4. In einem zweiten 5 ml Polystyrol Röhrchen, mit 60 ul 2M CaCl _2-Puffer, die Plasmid-DNA und Transfektion TE-Puffer (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) auf ein Gesamtvolumen von 480 ul. Für jede Petri-Schale, sollte Plasmiden in das Verhältnis von 10 ug PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 pg pCMVΔR8.3 und 2,5 mg pHCMV-G hinzugefügt werden.
5. Fügen Sie die Plasmid-DNA-CaCl _2-Gemisch tropfenweise zu der 2 X HBS Rohr, und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ein feiner Niederschlag bilden.
6. Fügen Sie die 960 ul der Mischung mit einer Pipette auf die Zellen getropft. Bei 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht.
7. Am nächsten Tag, entfernen Sie den Überstand und 10 ml frisches DMEM + 10% FBS und kontinuierlich Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht.
8. Nach 48 Stunden nach der Transfektion, Ernte des Virus durch das Entfernen des Überstandes und Überführung in 50 mL sterilen Röhrchen. Add frischen 10 ml frisches DMEM + 10% FBS in jede Petri-Schale und weiterhin Kultur über Nacht. Bewahren Sie die Virus-Überstand bei 4 ° C.
9. Fahren Sie mit bei 72 Stunden nach der Transfektion durch das Sammeln der Überstand Ernte. Kombinieren Sie all die Überstände und Zentrifuge die Überstände bei 500 xg für 15 Minuten, um Pellets und entfernen Zelltrümmer.
10. Der Überstand wurde gesammelt und durch ein 0,22 um Millipore-Filter filtriert. Das Virus wurde weiter durch Ausschluss-Säulen konzentriert.

2. Konzentrieren Sie sich Viruspartikel und Bestimmen Virustiter

1. Viralen Partikel wurden durch ein Ausschluss-Spalte (100.000 MW abgeschnitten, Centricoin) konzentriert. Viral Überstand wurde in die Säule geladen und zentrifugiert bei 6.000 xg bei 4 ° C für 15 Minuten.
2. Konzentrierte virale Überstand wurde gesammelt, aliquotiert und bei -80 ° C.
3. Der virale Titer wurde durch Infektion eines TNF-behandelten HIV-1-positiven Jacket Zelllinie, J1.1 7 bestimmt. Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte bei 2,5 x 10 ⁵ Zellen pro mL (100 mL Gesamtvolumen) kultiviert und infiziert mit 100 ml seriell verdünnt VNL-GFP-RRE-SA für eine Woche. Der Titer (TCID50) des Teilchens wurde durch Zählen der GFP positiven Vertiefungen nach der Methode von Reed und Muench 8 geschätzt.

3. Kennzeichnung HIV-1 positiven Zellen mit dem Lentivirale Partikel, VNL-GFP-RRE-SA

Set up: ein menschliches CD4 T-Zell-Linie, CEM-SS, wurde zum ersten Mal mit HIV-1 infiziert. Bei 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit dem lentiviralen Partikeln, VNL-GFP-RRE-SA Superinfektion. Nach Superinfektion für weitere zwei Tagen wurden GFP-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Als Kontrolle HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen wurden identisch mit VNL-GFP-RRE-SA infiziert. Nur die HIV-1-infizierten CEM-SS-Zellen führte zu GFP-positiven Zellen, nicht aber die HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen.

Vorgehensweise:

1. Zwei Stunden vor der Infektion, fügen polybrane bis zu einer Endkonzentration von 4 mg / mL. Zählen von Zellen und nehmen Sie 2 x 10 ⁵ Zellen für jede Infektion. Infect Zellen mit 200 ng (p24) von HIV-1 _NL4-3 für 2 Stunden.
2. Waschen der Zellen durch Zentrifugieren bei 300 xg für 10 Minuten, resuspendierenZellen in 2 x 10 ⁵ Zellen / ml und bei 37 ° C für 48 Stunden.
3. Zählen von Zellen und nehmen Sie 2 x 10 ⁵ Zellen pro Infektion mit VNL-GFP-RRE-SA. Add 100 ml VNL-GFP-RRE-SA und bei 37 ° C über Nacht. Wash-Zellen und Zellen in 2 x 10 ⁵ Zellen / ml.
4. Führen Durchflusszytometrie 48 Stunden nach Superinfektion. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 500 ml 1% paraformaldehede, bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert, und dann auf einem FACScan-Analysator (Becton Dickenson) analysiert.

4. Repräsentative Ergebnisse

Wenn die Versuche erfolgreich durchgeführt werden, wird eine beträchtliche GFP Bevölkerung in HIV-1-infizierten CEM-SS-Zellen durch das Durchflusszytometer nachgewiesen werden, wohingegen in der Kontrollgruppe, GFP-positive Zellen werden nicht in HIV-1 infizierten CEM-SS erkannt werden Zellen.

Wenn die Versuche erfolgreich durchgeführt werden, die Rev-abhängige lentiviralen Vektor, VNL-GFP-RRE-SA wird die hochspezifischen Nachweis der Replikation von HIV in lebenden Zell-Populationen zu ermöglichen, durch Messung der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP) Ausdruck. In diesem Beispiel wurden geerntet CEM-SS-Zellen mit einem PE-markiertem Ratte monoklonale Antikörper gegen Maus-CD24, HSA gebeizt und dann mit einem Durchflusszytometer für HSA und GFP-Expression analysiert.

Abbildung 1. Wie hier gezeigt, eine beträchtliche GFP Bevölkerung war in HIV-1-infizierten Zellen mit VNL-GFP-RRE-SA (Abbildung 1c) superinfiziert erkannt. Im Gegensatz dazu waren GFP-positiven Zellen weder in HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen ohne lentiviralen Superinfektion (Abbildung 1a) oder HIV-1 infizierten Zellen mit lentiviralen Superinfektion (Abb. 1b). Festgestellt

Diskussion

Wie bei den früher entwickelten Tat-abhängigen Expressionsvektoren beschrieben, die Rev-System ist hier eine Ausbeutung eines entwickelten HIV-Prozess. Die Einbeziehung von Rev-Abhängigkeit macht die LTR-basierten Expressionsvektor in hohem Maße von der Anwesenheit der Replikation von HIV. Die Anwendung dieses Vektors wie hier berichtet, ein HIV-abhängigen Reporter-Virus bietet eine neuartige neuen Ansatz zur HIV-positive Zellen zu identifizieren. Der Vektor erlaubt Untersuchung von lebenden Zellen, ausdrücken kann jedes Gen für Grundlagen-oder klinischen Erprobung, und als pseudo-typed Lentivirus hat Zugang zu den meisten Zelltypen und Geweben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C