Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Zusammenfassung

Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.

Zusammenfassung

Isolierung von Immunzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) während der Infektion, Trauma, Autoimmunität oder Neurodegeneration zu infiltrieren, ist oft erforderlich, um ihren Phänotyp und Effektor-Funktionen zu definieren. Histochemische Ansätze sind instrumental, um die Lage der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundenen ZNS-Pathologie zu analysieren. Allerdings sind in-situ Histochemie und Immunfluoreszenzfärbung Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die zu einem einzigen Zeitpunkt genutzt werden, um Immunzellen Subtypen in einem bestimmten Gewebe zu charakterisieren können, beschränkt. Daher sind histologische Ansätze in Verbindung mit Immun-Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie kritischen vollständig zu charakterisieren die Zusammensetzung der lokalen ZNS Infiltration. Dieses Protokoll basiert auf der Trennung von ZNS-Zellsuspensionen über diskontinuierliche Percoll Gradienten basiert. Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für die Identifizierung von verschiedenen Immunzellen Populationen in einer einzigen Probe mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.

Protokoll

Vorbereitung der Reagenzien

Bereiten Lager isotonischen Percoll (SIP), 4 ml pro Gehirn, indem man 9 Teile Percoll mit einem Teil 10X HBSS ohne Ca + + und Mg + +.

Bereiten Sie SIP bei 70% in 1X HBSS ohne Ca + + und Mg + +, 2 ml pro Kopf in einen 15 ml-Polypropylen-konischen Rohr verzichtet.

Hinweis: Es wird empfohlen, Percoll bei Raumtemperatur verwendet werden sollte, falls verwendet Kälte, neigen Zellen zu verklumpen und Zellseparation ist weniger effizient.

Tissue-Sammlung und Homogenisierung

Anesthetize Mäusen und perfuse durch den linken Ventrikel mit eiskaltem 1X HBSS. Dissect Gehirn und Rückenmark und zu pflegen in RPMI ohne Phenolrot, bis alle Mäuse getötet werden.

Legen Gewebe in 7 oder 15 ml Dounce Homogenisator mit 3 ml RPMI sanft eine Zellsuspension mit einer locker sitzenden Pistill (A-Größe) durch eine Oberschenkel-Montage Stößel (B Größe) zur weiteren distanzieren Gewebe gefolgt. Füllen Sie das Volumen des Zell-Suspensionen zu 7 ml mit RPMI.

Gradient einrichten

3 ml SIP zu der Zellsuspension zu einer endgültigen 30% SIP machen

Langsam Schicht der 10 mL Zellsuspension auf dem 70% SIP. Dies ist der wichtigste Schritt des Verfahrens, Verwendung einer Pipette-Hilfe in der Schwere-Modus zu vermeiden Mischen von 70% und 30%-Lösungen gesetzt. Eine sehr klare flache Linie sichtbar sein soll an die 70% -30%-Übergang.

Zentrifuge 30 min bei 500G 18 ° C. Stellen Sie sicher, Zentrifuge wird mit minimalen oder keinen Bremse zu stoppen, so dass die Interphase nicht gestört wird.

Mit einem Transfer-Pipette vorsichtig ab, die Schicht der Ablagerungen aus dem oberen Ende des Röhrchens sammeln und 2,0-3,0 ml der 70% -30% der Interphase in ein sauberes konisches Rohr mit 8 ml 1X HBSS. Stellen Sie sicher, dass die Percoll mit der Interphase etwa das Dreifache verdünnt wird, mischen ein paar Mal durch Umdrehen und centrifugre 7 min bei 500G bei 18 ° C.

Pellet in 1 ml der Zell-Färbepuffer und überträgt es auf eine 1,5 ml-Tube und waschen ein weiteres Mal mit einem Mikro-Zentrifuge bei 10.000 G 1 min bei 4 ° C.

Antikörper-Färbung

Resuspendieren Pellets in 50 ul des gereinigten anti-Maus CD16/CD32 verdünnt 1:200 in Zelle Färbepuffer an den Fc-Bindungsstellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.

Add 50 ul Antikörper-Cocktail-Mix und Inkubation auf Eis für 30 min. Jeder Antikörper zunächst titriert werden, um eine optimale Verdünnung zu beurteilen. Verwenden Sie geeignete Fluorochrom Kombinationen ausgewählt nach den Möglichkeiten der Laser-und Filter-Einstellungen Ihres jeweiligen Durchflusszytometer.

Wash-Zellen in Zellen Färbepuffer, resuspendieren Pellets in 100-200 ul der Zelle Färbepuffer und analysieren sofort im Durchflusszytometer oder alternativ Zellen können in 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendiert vorbereitet und gespeichert werden über Nacht bei 4 ° C .

Repräsentative Ergebnisse:

Nach dem Spinnen der Gradienten, sollte die 70% -30% der Interphase haben einen definierten weißen Heiligenschein, und die Quantifizierung der Zellen aus einer naiven Maus erholt sollte 3-5 x10 ⁵ Zellen pro Maus (Gehirn und Rückenmark) zu ergeben. Entzündete Gehirn haben könnte reichen Zahl der Entzündungszellen in Abhängigkeit von der ZNS-Beleidigung oder Krankheit Modell (Abbildung 1).

Abbildung 1. Isolierung von mononukleären Zellen aus naiven und EAE-Hirn-zu Spitzenzeiten Krankheit. Gehirnzellen Suspensionen wurden über diskontinuierliche 70% / 30% Percoll Gradienten getrennt. Zellen gefärbt wurden mit Fc-Block inkubiert, gefolgt von anti-CD45-Antikörper für 30 min auf Eis. Die Zellen wurden in Zellfärbung Puffer gespült und fest in 2% PFA vor Übernahme in ein LSR-II. CD45 Intensität ist in der Y-Achse, wo drei unterschiedliche Populationen visualisiert werden gemessen. Die weitere Charakterisierung der Immunabwehr Phänotyp CD45 ^hallo infiltrierenden Zellen erfolgt über zusätzliche Antikörper und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.

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Diskussion

Analysen von Zelloberflächenmarker in CNS Leukozyten aus normalen und entzündeten Mausgeweben seit mehreren Jahrzehnten ^1-3 verwendet worden. Isolation Protokolle sind in der Trennung von Mikroglia und Leukozyten durch Dichtezentrifugation ^4. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung von CNS Leukozyten mit diskontinuierlichen Percoll-Gradienten. Nach der Isolierung von Zellen, Färbung mit verschiedenen Antikörpern wie, aber nicht beschränkt auf-CD45 ermöglicht CD...

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Materialien