Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

Zusammenfassung

Perfusion Dezellularisierung ist eine neuartige Technik, um ganze Leber Gerüste, dass die Orgel extrazellulären Matrix Zusammensetzung und Mikroarchitektur behält produzieren. Hierbei wird das Verfahren zur Herstellung von ganzen Organs Gerüste mit Perfusion Dezellularisierung und anschließende Wiederaufforstung mit Hepatozyten beschrieben. Funktionelle und transplantierbaren Leber Transplantate kann mit Hilfe dieser Technik werden.

Zusammenfassung

Die Leber ist ein komplexes Organ, das konstante Perfusion erfordert für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und Beseitigung von Abfällen, um ¹ überleben. Die Bemühungen zu erstellen oder zu imitieren die Leber Mikrostruktur mit Gründen up-Ansatz mit Tissue Engineering und Mikrofabrikationstechniken sind nicht erfolgreich gewesen, so weit durch, um diesen Entwurf Herausforderung. Darüber hinaus haben synthetische Biomaterialien verwendet werden, um Gerüste für Leber Tissue Engineering-Anwendungen zu erstellen bei der Induktion der Geweberegeneration und Reparatur zu einem großen Teil durch das Fehlen von spezifischen Zell-Bindung Motive, die die richtige Zelle Funktionen ² induzieren wäre begrenzt. Dezellularisierte nativen Gewebe wie Blutgefäße ³ und Haut ⁴ auf der anderen Seite haben viele Anwendungen im Tissue Engineering gefunden, und sofern eine praktische Lösung für einige der Herausforderungen. Der Vorteil der dezellularisierte nativen Matrix ist, dass es, bewahrt in einem Umfang, der ursprünglichen Zusammensetzung und die Mikrostruktur, also die Verbesserung Zelladhäsion und Reorganisation ^5.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methoden zur Perfusion-Dezellularisierung der Leber, so dass eine intakte Leber biologisches Gerüst, dass die Struktur der großen Blutgefäße behält erhalten ist durchzuführen. Des Weiteren beschreiben wir Methoden, um diese bioscaffolds mit adulten primären Hepatozyten recellularize, die Schaffung eines Lebertransplantation, die funktionelle in vitro ist, und hat das Schiff den Zugang erforderlich für die Transplantation in vivo.

Protokoll

1. Liver Dezellularisierung

1. Ernte einer Rattenleber mit Pfortader Kanülierung mit und 18-Gauge-Katheter. Lassen Sie die untere und obere Hohlvene zu öffnen. Halten Sie die Orgel hydratisiert in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 10-cm-Petrischale.
2. Einrichten einer Perfusion System, das von 8-Liter-Behälter, Schlauchpumpe und einer Blasenfalle besteht.
3. Füllen Sie die Perfusion mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und halten Sie es läuft für 10 Minuten. Füllen PBS in einem 10-cm-Petrischale und reduzieren die Fließgeschwindigkeit des Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu 1 mL / min.
4. Sorgfältig Übertragung der geernteten Leber zu den Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gefüllt 10-cm-Petrischale.
5. Fahren Sie mit PBS Perfusion über Nacht.
6. Starten Perfusion mit 0,01% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser für 5 Minuten.
7. Perfundieren mit PBS für 1 Stunde.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1,6 und 1,7 noch dreimal die Erhöhung der SDS Perfusion auf 10, 15 und 20 Minuten zu jeder Zeit.
9. Weiter Perfusion mit 0,01% (w / v) SDS für 24 Stunden.
10. Weiter Perfusion mit 0,1% (w / v) SDS für 24 Stunden.
11. Perfundieren mit 0,2% (w / v) SDS für 3 Stunden.
12. Perfundieren mit 0,5% (w / v) SDS für 3 Stunden.
13. Perfundieren mit destilliertem Wasser für 15 Minuten.
14. Perfundieren mit 1% (w / v) Triton X-100 in destilliertem Wasser für 30 Minuten keine gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen.
15. Zum Waschen der dezellularisierte Leber-Matrix (DLM), perfuse mit PBS für 2 Stunden.
16. Optional: reseziert allen Lappen mit Ausnahme der Mittellappen.
17. Bewahren Sie die DLM in einer sauberen und verschlossenen Petrischale in PBS bei 4 ^o C eingeweicht, bis sie verwendet (Abbildung 1).
18. Um sterilisieren DLM: 1) Spülen Sie die DLM mit sterilem PBS mit 0,1% (v / v) Peressigsäure und 4% (v / v) Ethanol und Inkubation für 3 Stunden bei 4 ^o C. 2) mit sterilem PBS 2 mal waschen. 3) mit sterilem PBS mit 2% Penicillin-Streptomycin, 10ug / mL Gentamicin und 2,5 ug / ml Amphotericin B. Bewahren Sie die dezellularisierte Leber in der gleichen Lösung bei 4 ^o C bis bereit, für recellularization Experimenten Wash.

2. Recellularization von dezellularisierte Leber Matrix

1. Einrichten einer Perfusion System, das von einer Perfusionskammer, Schlauchpumpe und einer Blasenfalle unter sterilen Bedingungen besteht. Füllen Sie die Perfusion mit 200 ml Kulturmedium, z. B. hohe Glukose-DMEM (Sigma), 10% fötalem Rinderserum (Hyclone,), 100 U mL ^-1 Penicillin und 100 ug mL ^-1 Streptomycin (Invitrogen).
2. Legen Sie die dezellularisierte Leber-Matrix in der Perfusionskammer und verbinden Sie die DLM die Perfusion System durch die Pfortader Kanüle, während die Pumpe mit 5 ml / min läuft, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
3. Lassen Perfusion des Mediums durch die DLM für 30 Minuten.
4. Isolieren primären Hepatozyten aus einer erwachsenen Ratte mit mindestens 90% Lebensfähigkeit.
5. Stoppen Sie die Strömung in der Perfusion und injizieren Sie langsam 50 Millionen Hepatozyten (in 1-3 ml Kulturmedium) in Perfusionssystem durch die Blasenfalle.
6. Starten Sie den Durchfluss bei 10 mL / min und rezirkulieren das Medium für 10 Minuten.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 bis insgesamt 200 Millionen Zellen in die DLM (Abbildung 2) ⁶ eingeführt werden.
8. Wenn alle Zellen in die DLM perfundiert werden, sammeln das Perfusat in vier 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 600 rpm für 10 Minuten. Entsorgen Sie die Überstände und sammeln Sie die Pellets in einem einzigen Rohr. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und die Lebensfähigkeit über Trypanblau-Ausschluss für die Aussaat Effizienz zu bestimmen.

3. In-vitro-Kultur der Recellularized Leber Graft

1. Einrichten einer Perfusion System, das von einer Perfusionskammer, Schlauchpumpe, Oxygenator und eine Blasenfalle unter sterilen Bedingungen (Abbildung 3) besteht. Füllen Sie die Perfusion mit 50 ml Kulturmedium, z. B. Williams 'E (Sigma), 5% fötalem Rinderserum (Hyclone,), 0,5 U mL ^-1 Insulin (Eli Lilly), 20 ng mL ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL ^-1 Glukagon (Bedford Laboratories), 7,5 pg mL ^-1 Hydrocortison (Pharmacia), 100 U mL ^-1 Penicillin und 100 ug mL ^-1 Streptomycin (Invitrogen).
2. Legen Sie die recellularized Lebertransplantation in der Perfusionskammer und verbinden Sie die DLM die Perfusion System durch die Pfortader Kanüle, während die Pumpe mit 5 ml / min läuft, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
3. Aseptischen Bedingungen in der Nähe der Perfusionskammer und dicht schließen, um ein Auslaufen während der Kultur zu vermeiden.
4. Übertragen Sie die Perfusion System in einen Inkubator, dass 37 ^o C ist und 10% CO ₂ und erhöhen die Perfusionsflussrate bis 15 mL / min.
5. Verbinden Sie den Oxygenator zu einem 95% O ₂ und 5% CO _2-Gasgemisch Tank und stellen Sie den Gas-Durchfluss bis 0,5 Liter / min. Dies sollte erreicht eine Sauerstoff-Partialdruck von NaherungTely 400 mmHg.
6. Die Kultur kann bis zu 10 Tagen mit täglich wechselnden Kulturmedium weiter. Das Kulturmedium kann täglich zur Überwachung der Leberfunktion des Transplantats, wie Albumin, Harnstoff und insgesamt Gallensäure Sekretion abgetastet werden. Am Ende der Kultur Frist kann der recellularized Lebertransplantation für molekulare und histologische Analyse beprobt werden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die komplette Dezellularisierung einer Rattenleber dauert etwa 72 Stunden mit dem beschriebenen Protokoll. Die resultierende Matrix behält 100% der fibrillären Kollagen, 50% der Glykosaminoglykane und nur 5% der DNA des nativen Leber (Tabelle 1) ^6. Die vaskuläre Struktur der Matrix bleibt erhalten, wie durch Korrosion Gieß-und Rasterelektronenmikroskopie Analyse (Abbildung 4) ⁶ belegt. Die Anwesenheit des vaskulären Mikroarchitektur innerhalb der DLM erleichtert die Wiederbesiedlung mit Zellen mit einem Wirkungsgrad von 96% und die anschließende Perfusion in vitro-Kultur. Die recellularized Leber Transplantat kann bis zu 10 Tage in vitro kultiviert werden und zeigt geeignete Leber funktioniert als über Albumin, Harnstoff und insgesamt Gallensäure Sekretion (Abbildung 5) ⁶ bestätigt.

Abbildung 1. Dezellularisierte Leber-Matrix am Ende des Dezellularisierung Prozess. (A) die ganze Leber (b) der Mittellappen nach Resektion.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der recellularization der DLM.

Abbildung 3. Perfusion System-Setup für In-vitro-Kultur der recellularized Lebertransplantation.

Abbildung 4. Die mikrovaskuläre Struktur wird in der Leber dezellularisierte Matrix beibehalten. Ausgusspräparat Bilder aus a) einer normalen Leber b) eine dezellularisierte Leber-, Portal-(rot) und venösen (blau) Gefäßsystem. Rasterelektronenmikroskopie Bilder des DLM c) ein Gefäß, d) ein Abschnitt mit Gallengang-like kleinen Gefäße (Pfeile), Scale Bars (a, b) 5 mm (c, d) 20 um.

Abbildung 5. Liver spezifischen Funktionen des recellularized Lebertransplantation während der in vitro Perfusion Kultur. a) Albumin-Sekretion (p = 0,5249), b) zur Herstellung von Harnstoff (p = 0,5271) und c) insgesamt Gallensäure-Sekretion (p = 0.0114). Die statistische Analyse der Differenz zwischen dem Experiment und der Kontrolle wurde über die 10 d Kultur Zeitraum von Friedman-Test bei a = 0,01 durchgeführt. Fehlerbalken stellen sem (n = 3).

	Frische Livera	Dezellularisierte Leber Matrix ein	p-Werte	% Der frischen Leber
	n = 4	n = 8
Collagen	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Mg pro g Leber)
Glykosaminoglykane	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Mg pro g Leber)
DNA	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg pro g Leber)

Tabelle 1. Die biochemische Zusammensetzung der dezellularisierte Leber-Matrix auf die native Leber verglichen.
^a Werte werden als Mittelwert ± SEM dargestellt

Diskussion

Die Perfusion Dezellularisierung hier beschriebene Methode produziert eine ganze Leber Gerüst, das die gleiche grobe Struktur und die vaskuläre Mikroarchitektur des nativen Leber hat. Das Gerüst hat eine extrazelluläre Matrix Zusammensetzung ähnlich der nativen Leber. Die recellularization Methode erreicht Wiederbesiedlung des Gerüsts mit Zellen mit hohem Wirkungsgrad und die Zellen lebensfähig bleiben und funktionelle während der in vitro-Kultur Zeitraum getestet. Mit dem Zusatz von nonparenchymal Zell...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149