Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

Zusammenfassung

Neuartige computergestützte Methoden der großflächigen Beschaffung und Analyse der immunhistochemisch gefärbten Pankreas Proben werden beschrieben: (1) Virtuelle Scheiben Erfassung der gesamten Abschnitt, (2) Messe Analyse der umfangreichen Daten, (3) Rekonstruktion von 2D-Virtuelle Schnitte , (4) 3D-Mapping-Insel, und (5) Mathematische Analyse.

Zusammenfassung

Die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse ist eine einzigartige Mikro-Orgel von mehreren Hormon sezernierenden endokrinen Zellen wie Beta-Zellen (Insulin), alpha-Zellen (Glukagon) und delta-Zellen (Somatostatin), die in der exokrinen Gewebe eingebettet sind, und bestehen aus 1 zusammengesetzt - 2% der gesamten Bauchspeicheldrüse. Es besteht eine enge Korrelation zwischen Körper und Bauchspeicheldrüse Gewicht. Insgesamt Beta-Zellmasse nimmt ebenfalls proportional zu der Nachfrage nach Insulin im Körper auszugleichen. Was entgeht dieser verhältnismäßig Expansion ist die Größenverteilung der Inseln. Große Tiere wie Menschen haben ähnliche Insel Größenverteilungen mit Mäusen, was darauf hindeutet, dass diese Mikro-Orgel eine bestimmte Größe begrenzt funktionsfähig sein muss. Die Unfähigkeit der großen Tier Pankreata proportional größeren Inseln zu erzeugen, ist durch einen Anstieg in der Anzahl der Inseln und durch eine Erhöhung des Anteils der größeren Inseln in ihrer gesamten Insel Größenverteilung kompensiert. Darüber hinaus weisen Inselchen eine auffallende Plastizität in zelluläre Zusammensetzung und Architektur zwischen den verschiedenen Arten und auch innerhalb der gleichen Art unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir neue Ansätze für die Analyse biologischer Bilddaten, um die Automatisierung von analytischen Verfahren, die für die Analyse von großen und heterogenen Datensammlungen in der Studie von solchen dynamischen biologischen Prozessen und komplexen Strukturen erlauben zu erleichtern. Solche Studien haben aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Probenahme unvoreingenommene behindert worden und die Generierung großer Datenmengen genau zu erfassen die Komplexität der biologischen Prozesse der Insel Biologie. Hier zeigen wir Methoden, um unvoreingenommene "repräsentative" Daten innerhalb der begrenzten Verfügbarkeit von Proben (oder an die Probennahme zu minimieren) und die Standard-experimentellen Einstellungen zu sammeln und genau analysieren die komplexen dreidimensionalen Struktur der Insel. Computer-gestützte Automatisierung ermöglicht die Sammlung und Analyse von großen Datenmengen und sorgt auch unvoreingenommene Interpretation der Daten. Darüber hinaus die präzise Quantifizierung der Insel Größenverteilung und räumlichen Koordinaten (dh X, Y, Z-Positionen) führt nicht nur zu einer genauen Darstellung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Struktur und Zusammensetzung, sondern auch ermöglicht es uns, Muster während der Entwicklung und Anpassung an die Veränderung Bedingungen zu identifizieren durch mathematische Modellierung. Die Methoden in dieser Studie entwickelten gelten für Studien von vielen anderen Systemen und Organismen sowie.

Protokoll

1. Erstellen von virtuellen Scheiben Immunhistochemisch Stained Images

1. Öffnen StereoInvestigator. Legen Sie die sauberen Objektträger hält die Probe in das Mikroskop Halter und visualisieren sie in Stereo Investigator, indem Sie auf "Erwerb" und dann "Live-Bild" (Acquisition → Live-Bild). Bestimmen Exposition für jeden Kanal, in unserem konkreten Beispiel, Kanal 2 für die DAPI, Kanal 3 für GFP, Channel 4 für RFP, Channel 5 für Cy5 und Channel 6 für Cy7 verwendet. Verwenden Sie die "Video Histogram"-Fenster, das die Intensität der Fluoreszenz-Displays, um die Belichtung zu bestimmen. Entsprechende Fluoreszenzintensitäten sind erreicht, wenn die Intensität Schwänze ab am rechten Ende des Video Histogramm. Die Grenzwerte können in der "Camera Settings"-Fenster geändert werden. Das Video Histogramm kann mit dem Mikroskop Fokussierrad fokussiert werden.
2. Vor der Erstellung eines virtuellen Slice, Kontur der Probe durch einen Klick auf dem Bildschirm an einem Punkt von der Probe entfernt, die einen Verweis Punkte-Marke wird, und klicken Sie dann auf um die Kontur der Probe. Wenn die Kontur vollständig ist, rechte Maustaste und wählen Sie "Close Contour", um die Anfangs-und Endpunkte zu verbinden.
3. Sobald die Kontur geschlossen ist, erfasst eine virtuelle Scheibe für die Probe (Acquisition → Acquire Virtuelle Slice). Wenn die virtuelle Scheibe Fenster Optionen zu öffnen, wählen Sie "High Speed ​​Acquire" sowie die automatische Fokussierung, indem Sie das Kontrollkästchen neben "Manuell". Speichern Sie die Datei.
4. Die virtuelle Scheibe Vorfokussierung muss durch die Auswahl kalibriert werden (rechte Maustaste → Zu Site List Focus) und manuell Fokussierung mehrere zufällige Abschnitte, dh Websites, in der virtuellen Scheibe Vorschau. Wenn mehrere Standorte wurden konzentriert, starten Sie die virtuelle Scheibe (rechte Maustaste → Start Virtual Slice mit Vorfokussierung). Nach der virtuellen Scheiben für die erste Probe abgeschlossen ist, zum nächsten Kanal zu wechseln und die Belichtung entsprechend an. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 für jeden Kanal.

2. Computer-assisted Two-Dimensional Analysis

Die Quantifizierung der Islets

1. Die Bilder werden dann verarbeitet mit einem ImageJ Makro namens "IHCVS", die zuerst bereitet geladenen Bilder zur Analyse und Quantifizierung Merkmale von Inseln wie zelluläre Zusammensetzung (dh jeder Bereich der beta-, alpha-und delta-Zell-Populationen und Inselchen Gebiet an der Summenwert). Der Stapel wird in die einzelnen Kanäle in ImageJ aufgeteilt, wobei jedes einzelnen Kanals ein eigenes Bild über die immunhistochemische Färbung Basis zeigt. Jedes Bild wird dann automatisch Schwellenwert, nach dem ein 8-Bit-Schwarz-Weiß-Bild oder eine Maske, der Schwellenwert Bild erzeugt wird. Die separaten Kanal Bilder werden dann zusammen rechnerisch in einem zusammengesetzten Maske hinzugefügt und ImageJ der eingebauten Partikel-Analyse basiert auf der Composite-Bild durchgeführt.
2. ROIs werden dann identifiziert, während ohne Partikel, die kleiner als eine einzige Beta-Zellen (<170 um ^2; Fläche berechnet einen Durchmesser von ~ 15 &mgr; m; Hara et al, 2003.). Der resultierende ROIs werden analysiert und quantifiziert ImageJ; Quantifizierung Perimeter (Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo die Zahl 1,0 zeigt einen perfekten Kreis), Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) und in der Mitte sind Koordinaten für jeden analysierten Region, so dass die Insel Verteilung mathematisch analysiert werden kann unter Verwendung verschiedener Kombinationen dieser Parameter und aufgezeichnet in einer 3D-Grafik, deren Daten werden für die mathematische Modellierung verwendet werden. Eine einzelne virtuelle Scheibe Bild ist in 30 Sekunden analysiert. Mehrere Bilder können durch die Einbettung der Bildverarbeitung und-analyse Skript in einer Schleife Syntax von ImageJ Makrosprache unterstützt analysiert werden. Die Schleife öffnet alle Dateien in einem bestimmten Verzeichnis, analysiert die Bilder und gibt Ergebnisse in einen neuen Standort als Excel-Datei.
3. Die aggregierten Ergebnisse werden in eine Excel-Tabelle gespeichert, die Speicherung von Daten wie Fläche, Umfang, Rundheit, Feret der Durchmesser und Inselchen Zentrum für jede Insel, zusammen mit den entsprechenden Zahlen in der Abbildung dargestellt.

Computergestützte Analyse und Histogramm-Setup

1. Mathematica-Skripte, die automatisch einmal gestartet ausführen, werden verwendet, um die Spreadsheet-Daten gesammelt Prozess, in Höhe von Hunderttausenden von Einträgen. Einer der kritischen Prozesse, die ausgeführt werden ist eine Frequenz-Analyse, die ein Histogramm zur Größenverteilung zu untersuchen und auch Ausreißer in den Daten zu bestimmen Konstrukte. Unter dem Skript ist insgesamt Inselchen Bereich gemessen und mit anderen Parametern, insbesondere zu Zeitpunkten oder das Alter der Bauchspeicheldrüse, und dann entsprechend in einem Diagramm angezeigt.

3. Dreidimensionale Rekonstruktion von zweidimensionalen Immunhistochemisch Stained virtuellen Schnittbilder

3D-Rekonstruktion von Virtual Slices

1. Kopieren Sie das Skript ("im_jp2_2_tiff") in das Verzeichnis (also Ordner)enthält die jp2 Bilder. Führen Sie das Skript mit der Linux-Shell durch Eingabe von "./im_jp2_2_tiff" in die Konsole und dann Enter drücken. Wenn Sie dieses Skript für Sie automatisch alle der jp2 Bilder in dem Verzeichnis, in TIFF-Dateien, die das Format in den Bau und die Quantifizierung von dreidimensionalen Stapel aus dem virtuellen Scheiben verwendet wird. (Hinweis:. Geben Sie "chmod + x im_jp2_2_tiff", wenn das Skript nicht ausgeführt, die den Text-Datei in ein Script umwandeln, so dass es richtig laufen kann)
2. Wenn alle erfassten Bilder jp2 TIFF-Dateien umgewandelt wurden, sind sie bereit, für die Analyse in ImageJ verwendet werden.
3. Mit ImageJ, öffnen Sie alle Bilder für die erste Probe (fünf Bilder in diesem Fall: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) auf und verschmelzen sie zu einem Bild (Bild → Farbe → Kanäle zusammenfügen). Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der Proben. Wenn alle Proben als einzelne Bilder wurden zusammengefasst, reinigen Sie die Bilder durch unerwünschte Bereiche mit dem "Polygon-Selektionen" Werkzeug und füllt sie in (Edit → Fill). (Die Größe der Bilder auf eine kleinere Größe, wenn nötig). Dann konvertieren jedes Bild in ein RGB-Bild (Bild → Typ → RGB-Farbe). Schließlich erstellen Sie einen Stapel aus den Bildern (Bild → Stacks → Bild zu Stacks), nach der sie weiter mit dem "Stack Reg" plugin ausgerichtet werden, falls erforderlich. Letztlich Zusammenlegung der Kanäle und dann die Kombination der Bilder erstellt ein 3D-montage aller Inseln in der gesamten Bauchspeicheldrüse. Um das Bild auf "Plugins" klicken und dann "3D-Viewer."

4. Islet Mapping

Sammeln Bildstapel

1. Situate der ganze Berg Pankreasinseln unter dem Mikroskop.
2. Öffnen Sie die Slidebook Software. Besuchen Sie das "Capture und Focus Control" durch Drücken von "Strg + Umschalt + E." In der "Focus Control"-Fenster, das Ziel festgelegt, bis 20X oder 40X, abhängig von der Größe der Insel. Bewerben Wasser, wenn mit einem Eintauchen in Wasser Objektiv.
3. Um die Mikroskop-Okular zu verwenden, um Inseln zu finden, stellen Sie "Bin" zu 2X und setzen Sie die Filter-Set für User1 in der "Focus Controls" Fenster. "Emission Selection" sollte zu 100% Eyes and Neutral Density auf 1 gesetzt werden. Klicken Sie auf "GFP ey" und dann "Open Fluor."
4. Zur Visualisierung der Probe in Slidebook, um den Fokus wieder Controls Fenster und schalten Sie "Filter Set" auf "Live" und klicken Sie auf "GFP ds." Verwenden Sie den Joystick zum Zentrum der Insel in die Kamera 1 Fenster so gut wie möglich. Fokus auf eine Tiefe irgendwo in der Nähe der Mitte der Insel, wo die Zellen leicht zu erkennen.
5. In der "Focus-Steuerelemente", wählen Sie die "Z Register." Klicken Sie setzen in der oberen linken Ecke des Fensters, um die aktuelle Tiefe als Referenzpunkt gesetzt. Verwenden Sie den Umfang die Steuerung an den obersten Tiefe der Insel in die Funktionen klar erkennbar sein scrollen und auf "Set-Top." Blättern Sie zum Ende der Insel und klicken Sie auf "Set Bottom." Klicken Sie auf "Go", um den Bezugspunkt zurück.
6. Im Capture-Fenster, "Bin Factor" auf "2X" und stellen Sie "Filter Set" auf "Live". Stellen Sie den "Capture" auf "3D" (und nur 3D). Auf der rechten Seite des Fensters, klicken Sie auf "Use Top und Bottom Position." Klicken Sie auf "Return to Point nach Aufnahme Reference." Stellen Sie die "Step Size" auf "3".
7. Unter den "Filter Set Box", wählen Sie DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU und Cy5 DSU. Für jeden, klicken Sie auf "Best Find" unter "Belichtung anpassen", klicken Sie dann auf "Test", um sicherzustellen, dass die gewählte Exposition geeignet ist. Klicken Sie auf "Start", um die Aufnahme zu beginnen.
8. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, stellen Sie die Pegel wie nötig und ändern Sie die angezeigte Farbe für RFP auf Weiß. Speichern Sie die Folie und gehen Sie zu → Export → TIFF-Serie ansehen. Geben Sie den Namen des Schlittens mit einem Schuss am Ende und zu speichern. Dutzende von einzelnen TIFF-Dateien erstellt werden, so kann es hilfreich sein, um jede Insel das Image Stack in einem separaten Ordner zu halten.

Mapping Bildstapel

1. Öffnen Stereo Investigator. Visualisieren Sie das Bild durch das Öffnen der Bildstapel (File → Image Stack → Image Stack Open). In der "Image Scaling Menü" set "Abstand zwischen den Bildern" zu 3,00 um. Zur Korrektur der 2X Binning in Slidebook, wählen Sie "Override X-und Y-Skalierung" und "User für Quelle von X und Y angegeben" Skalierung, und geben Sie 0,65 für X und Y.
2. Zentrieren Sie das Bild, indem Sie in der Mitte der Insel von Interesse in der "Makro-Fenster." Mark mindestens eine Zelle mit den entsprechenden Marker. Beta-Zellen erscheinen grün, wird alpha-Zellen erscheinen rot, und delta-Zellen weiß erscheint, benutzen Sie Marker 2 (ein hohler Kreis), um Beta-Zellen, Marker 5 (ein hohles Dreieck) markieren, um den Alpha-Zellen markieren und Markierung 6 ( ein hohles Dreieck), um delta-Zellen. Die Zellen sollten in den Mittelpunkt ihres Kerns, die blau erscheinen wird, wenn die Probe wurde mit DAPI gefärbt markiert werden.
3. Sobald mindestens eine Zelle markiert wurde, zeigen die "Orthogonal View" über das Symbol in der oberen Menüleiste. Check "Z-Filter" und "Symmetric." Das Spektrum should bis 15,00 eingestellt werden. Ab das 0,0-Z-Ebene, durch die Insel mit dem Mausrad scrollen und markieren Sie die Zelle mit der entsprechenden Markierung. Jede Zelle darf nur einmal in den Mittelpunkt seiner Tiefe gekennzeichnet werden. Nach Beendigung Kennzeichnung jedes der Z-Ebenen, die "Z-Filter aktivieren" kann deaktiviert werden. Dadurch werden alle von den Markern von allen Z-Ebenen.
4. Wenn jede Zelle markiert wurde, speichern Sie die Datei als "DAT"-Datei, dann gehen Sie zu → Export Tracing-Datei. Speichern Sie die Verfolgung als "TXT"-Datei. Klicken Sie auf "New Data File", um den Arbeitsbereich, bevor Sie neue Inseln Karte klar.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Die Erstellung des virtuellen Slices aus einer immunhistochemisch gefärbten Bauchspeicheldrüse Probe ermöglicht es, alle von den endokrinen Zellen zu untersuchen (alpha, beta und delta-Zellen) in der gesamten Bauchspeicheldrüse, die beide zusammen als Inseln (Abbildung 1A) und einzeln in getrennten Kanälen ( Abbildung 1B). Mit Hilfe von Computer-Programmen und Skripten, kann eine Masse Analyse der umfangreichen Daten über diese virtuelle Schnitte durchgeführt werden. Insbesondere wird eine Partikelanalyse von Composite-Masken (Abbildung 1C) Ausgabe als Statistik-Tabelle mit Parametern wie Inselchen Fläche, Umfang (der Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo 1,0 stellt einen perfekten Kreis) und Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) für jede Insel entdeckt (Abb. 1D). Die groß angelegte Analyse dieser Bilder ergibt in der Produktion von insgesamt Inselchen Anzahl und Größe Verteilungshistogramme sowie einen detaillierten Vergleich der alpha-, beta-und delta-Zell-Bereiche. Darüber hinaus ist jede virtuelle Scheibe in einer Tiefe von etwa 5 um genommen, und alle einzelnen 2D virtuelle Schnitte sind weitere gestapelt werden, um eine 3D-Rekonstruktion des gesamten Pankreas Probe zu schaffen. Islet Mapping zeigt ein weiteres Beispiel nicht nur für den Fang von kleinen Inseln in 3D, sondern auch detaillierte computergestützte Analyse. Islet Mapping besteht aus der Erfassung der verschiedenen Inseln (Abbildung 2A) und die anschließende Markierung von alpha-, beta-und delta-Zellen an verschiedenen Z-Ebenen (Abbildung 2B) auf einer kleinen Insel in 3D (Abbildung 2C, D) zu visualisieren. Automatisierte mathematische Analyse abgebildet Inselchen zeigt deren zelluläre Zusammensetzung und Architektur, einschließlich Zell-Zell-Distanzen (Abbildung 2E) und kumulativen Wahrscheinlichkeiten von Zell-Zell-Distanz-Distributionen (Abb. 2F).

Abbildung 1. Großflächige Erfassung und Analyse von Insel-Verteilung mit Virtual Slice. A. Virtuelle Scheibe Ansicht eines menschlichen Pankreas-Abschnitt. a. Immunhistochemische Färbung für Insulin (grün), Glukagon (rot), Somatostatin (weiß) und DAPI (blau). b. Umgerechnet 8-Bit-Maske nach der automatischen Schwellenwert. Ein boxed-Bereich ist in BB Ansichten der einzelnen Kanäle vergrößert. a. delta-Zellen, b. beta-Zellen, c. alpha-Zellen, und d. verschmolzen zusammengesetztes Bild. C. Partikelanalyse auf Composite-Maske durchgeführt. Beachten Sie, dass jedes Inselchen Struktur einschließlich der kleinen Zellhaufen ist nummeriert (blau markiert). D. Statistik Tabelle der verschiedenen Parameter für die einzelnen Strukturen gemessen, die IDs, die tags in C dargestellt entsprechen müssen

Abbildung 2. Analyse immunhistochemische Virtuelle Slice. A. 3D-Punktwolke der Abbildung 1 zeigt Größe und Form Verteilung jedes Inselchen durch Parameter wie Fläche, Rundheit und Feret der Durchmesser. B. 3D-Punktwolke der Abbildung 1 zeigt zellulären Insel Zusammensetzung und Größe. C. Islet Größenverteilung der ganzen menschlichen Bereich Analyse aus Abbildung 1 zu einer logarithmischen Wahrscheinlichkeitsverteilungsdichte ausgestattet. D. Mathematische Analyse von zellulären Zusammensetzung Verhältnisse (beta-Zellen in grün, alpha-Zellen in rot und delta-Zellen in blau) für jedes Inselchen Wirkdurchmesser bin der Abbildung 1. E. a. Islet Größenverteilung von Stichproben immunhistochemische Analyse (links). Islet Größenverteilung der virtuellen Scheibe Analyse (rechts). b. Log-Normal Plot Vergleich der Stichproben immunhistochemische Analyse (rot) und virtuellen Bereich (blau).

Abbildung 3. Islet Mapping und mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur. A: Screen-Capture-Darstellung einer gemeinsamen Brennebene von einer 3D-Rekonstruktion von Stapel von Bildern des menschlichen Inselzellen in Stereo-Investigator hochgeladen (beta-Zellen in grün, alpha-Zellen in rot, delta-Zellen in weiß und Kerne in blau) . B: Fluoreszenz-Bilder (links) und entsprechende zugeordnete Daten (rechts) in drei verschiedenen Fokusebenen in einem Abstand von 10 pm gezeigt. C: Repräsentative Blick auf 3D-Rekonstruktion von Insel-Mapping-Daten. D: 3D-Rekonstruktion des Quartals-aufgeschnitten Insel auf die Koordinaten von Inselzellen Mapping erzielt wurden. E: Mathematische Analyse von zellulären Zusammensetzung und Architektur. Left. Relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei Zellen in einer einzelnen Zelle Bevölkerung. Right. Relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) zu testen. Left. Kumulative Wahrscheinlichkeiten von Zell-Zell-Distanz-Distributionen für Alpha-to-alpha, beta-to-beta und delta-to-delta-Zellen. Right. KS-Abstände für die entsprechenden drei kumulativen Wahrscheinlichkeiten.

Diskussion

Der Computer-assisted großflächige Visualisierung und Quantifizierung hier vorgestellten leisten vier zentrale Punkte in Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Studien: (1) Eine groß angelegte Analyse der Bauchspeicheldrüse Proben bietet einen umfassenden Überblick der gesamten Insel Größenverteilung und Inselchen Architektur. (2) Die 3D-Rekonstruktion und mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur weiteren Erleichterung der Prüfung der räumlichen Anordnung der endokrinen Zellen innerhal...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus