Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Zusammenfassung

Magnetic Resonance Imaging (MRI) ist ein zunehmend beliebtes Werkzeug für die Prüfung der Phänotyp genetisch veränderten Mäusen. Dieser Artikel beschreibt die Methoden notwendig, um High-Throughput-Phänotypisierung von genetisch veränderten Mäusen mit Multiple-Maus MRT zu erreichen.

Zusammenfassung

Das Feld der Maus Phänotypisierung mit Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) wächst schnell, motiviert durch die Notwendigkeit einer verbesserten Werkzeuge für die Charakterisierung und Bewertung von Mausmodellen menschlicher Erkrankungen. Die MRT ist eine ausgezeichnete Modalität für die Untersuchung von gentechnisch veränderten Tieren. Es ist in der Lage ganze Gehirn Abdeckung kann in vivo verwendet werden, und bietet mehrere Gegensatz Mechanismen zur Untersuchung verschiedener Aspekte der neuranatomy und Physiologie. Das Aufkommen der Hochfeld-Scannern zusammen mit der Fähigkeit, mehrere Mäuse gleichzeitig scannen ermöglicht eine schnelle Phänotypisierung von neuen Mutationen.

Effektive Maus MRT-Studien erfordern die Aufmerksamkeit auf viele Aspekte der Versuchsplanung. In diesem Artikel werden wir beschreiben, allgemeine Methoden, um qualitativ hochwertige Bilder für Maus Phänotypisierung unter Verwendung eines Systems zu erwerben, die Bilder Mäuse gleichzeitig in abgeschirmten Senden / Empfangen Hochfrequenz-(HF)-Spulen in einem gemeinsamen Magneten (Bock et al., 2003). Wir konzentrieren uns vor allem auf anatomische Phänotypisierung, eine wichtige und leicht zugängliche Anwendung, die ein hohes Potential für Auswirkungen in vielen Mausmodellen auf unsere Imaging-Center gezeigt hat. Bevor wir die einzelnen Schritte, um solche Bilder zu erwerben bieten kann, gibt es wichtige praktische Überlegungen für beide in vivo Bildgebung des Gehirns (Dazai et al., 2004) und Ex-vivo-Bildgebung des Gehirns (Spring et al., 2007), die beachtet werden sollten. Diese werden im Folgenden diskutiert.

Protokoll

1. Multiple-Maus in vivo Brain Imaging:

Bei der Abbildung lebender Tiere, mehrere wichtige Funktionen müssen in der gesamten Imaging-Sitzung zu präsentieren: 1) eine sichere Methode der Anästhesie, 2) Umwelt-Steuerung und 3) physiologische Überwachung. Darüber hinaus bei der Abbildung mehrere Fächer gleichzeitig, gibt es Komplexitäten in Bezug auf die einfache und schnelle Zubereitung und die Reproduzierbarkeit der Tier-Positionen zu Bildregistrierung erleichtern aufgenommen. Daher wurden drei große benutzerdefinierte Komponenten konstruiert und gefertigt: ein Ladesystem für die Mäuse in HF-Spulen innerhalb des MRI, eine Induktion Kammer einlegen, um Vorbereitung und eine Plattform mit eingebetteten Überwachung führt zu Position Standardisierung zu erleichtern.

Die Loading-System:

Die Maus loading-System besteht aus zwei Hauptteilen: der 'Maus Bienenstock "und der" Be-Array ". Die Maus hive Hauptfunktion ist es, sieben Millipede HF-Spulen (Varian NMR Systems, Palo Alto, CA) in einer hexagonalen Anordnung innerhalb des Magneten Bohrung Position. Die Belastung Array ist so konzipiert zu halten und zu transportieren mehrere Mäuse in 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen mit Löchern, durch deren Tipps gebohrt, um Eindringen von Narkosegas ermöglichen untergebracht. Nach der Mäuse anästhesiert und eine Schnittstelle für die Überwachung Ausrüstung Vorbereitung Bereich in der Nähe des Magneten sind, werden sie in den modifizierten Zentrifugenröhrchen gesteckt und montiert auf die Ladefläche Array. Nach der Montage alle Mäuse, ist die Belastung Array transportiert und in die Magneten positioniert und auf einer Schiene-System. Das Schienensystem kann das Array zu koppeln mit der Maus Bienenstock, wenn sich die Bohrung des Magneten geschoben. Als vollständig in der Magnet, der Zentrifugenröhrchen andocken der Narkose Abgabesystem innerhalb der HF-Spulen eingesetzt. Isofluran mit Sauerstoff vermischt wird von der Maus hive Ende der Probe durch ein Rohr entlang der Achse der jede einzelne Feder geliefert. Das Narkosegas-Gemisch strömt in den Rohren, vorbei an den Mäusen und wird durch eine aktive Spülung Gerät an der Rückseite des Ladens array (Abbildung 1) gesammelt.

Die Induction Kammer:

Da bildgebende Zeiten können bis zu drei Stunden, die Minimierung Tier Vorbereitungszeit ist entscheidend für die Maus Exposition auf die Anästhesie zu begrenzen. Daher haben wir eine eigene Induktion Kammer des Herstellungsverfahrens (Abb. 2) zu rationalisieren entwickelt. Der Brauch Induktion Kammer schafft eine einheitliche Umgebung für Induktions-und Verarbeitung von mehreren Mäusen. Hergestellt aus klarem Acrylglas, ermöglicht die Induktion Kammer verfügt selbstschliessend Silikon Iris Ports Betäubung Leckage zu minimieren und den Benutzer auf das interne Umfeld, ohne die Notwendigkeit für spezielle Handschuhe zugreifen. Im Vergleich zu herkömmlichen Maske und Schaltungen für eine einzelne Maus, ist die Induktion Kammer groß genug, um bis zu zwanzig Mäuse Haus und ermöglicht freien Manipulation der Mäuse ohne das Anbringen von schwerfälligen Röhren und Masken. Das Gerät ist mit einem konstanten Fluss von Narkosegas, das unter Verwendung eines passiven Spülsystem wird mitgeliefert. Resistive Heizelemente werden verwendet, um den Boden der Kammer Wärme an die Tiere die Körpertemperatur während der Vorbereitung zu halten.

Der Schlitten:

Eines der heikelsten und zeitraubende Aspekte der Vorbereitung Mäuse für die MRT sind die Anwendung von Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden und rektale Temperatur-Sonden. Darüber hinaus wurden viele der herkömmlichen Elektroden, wie Manschette und Nadelelektroden, fand das Tier Haltung macht es schwierig, die Positionierung zu standardisieren verzerren. Deshalb haben wir eine eigene formschlüssige Positionierung Plattform mit eingebetteter EKG erfunden, genannt Atmung und Temperatur-Sonden den "Schlitten" (US-Patent 7.146.936) (Abbildung 3). Motion-Beschränkungen von Klettverschlüssen gemacht wurden verwendet, um Bewegung des Kopfes zu begrenzen.

Multiple-Maus in vivo Bildgebung des Gehirns vor:

1. Alle Maus-Forschung erfordert lokale ACC (Animal Care Committee), IACUC (Institutional Animal Care und Verwenden Committee) oder eine gleichwertige Genehmigung für Maus Handhabung.
2. Alle Verfahren wie Identifikation und Wiegen der Tiere sollten unter einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) und in der MRT-Gerät durchgeführt werden. Die Tiere werden in einem autoklavierbaren Kunststoff überführt und in die MRI Induktion Kammer.
3. Mäuse sind in eine vorgewärmte Induktion Kammer mit 4% Isofluran und 4 L / min Sauerstoff anästhesiert. Die Tiere sind völlig betäubt, wenn sie zu paw Prise ansprechen. Fur aus der Brust entfernt mit einem Epiliergerät (Nair) gegebenenfalls einen besseren Kontakt mit EKG-und Temperaturüberwachung Geräte, die in eine eigene Schlitten gebaut wurden sind. Eve Salbe (Tears Naturale PM) ist für die Augen, um zu verhindern Trocknung aufgetragen und ca. 0,3 ml Kochsalzlösung wird subkutan verabreicht Hydratation beizubehalten.
4. Gd-DTPA-BMA (Omniscan) könnenverwendet werden, wenn Kontrastverstärkung gewünscht wird. Wenn Gd-DTPA verwendet werden soll, wird es in Kochsalzlösung (Endvolumen 300uL) verdünnt werden, verabreicht in einer Dosis von 1 mmol / kg vor der MR-Sitzung via IP.
5. Mäuse werden dann in einzelne Schlitten geladen, immobilisiert mit Kopfbänder und schieben in unbefristete 50ml konische Röhre (Abbildung 3). Bis zu 7 lebende Mäuse auf einmal gescannt werden. Nachdem alle Tiere mit physiologischen Überwachung verbunden geladen, stellen Sie die Isofluran-Ebene in der Magnet Bohrung bis 2% und der Sauerstoffgehalt zu 8 L / min.
6. Die konische Rohre werden in eine Docking-System (Abbildung 1) entwickelt, um Position Mäusen gleichmäßig in jedem HF-Spule in der Mitte des Magneten positioniert Bohrung montiert. Einmal geladen, kann Isofluran reduziert, um 0,9-2% liegen. EKG und Temperatur werden über jedes Tier im Laufe des Scans überwacht. Die Tiere sind warm gehalten im Laufe des Scans mit erwärmter Luft.
7. Die Dauer der einzelnen dreidimensionalen Scan ist ca. 3 Stunden. Die Details lauten wie folgt: schnelle Spin-Echo mit TR von 2300 ms und einer TEeff von 36 ms. Echo Zuglänge von 8 mit 1 Durchschnitt. Resultierende Bild-Auflösung beträgt 125 um (Abbildung 4).
8. Wenn der Scan abgeschlossen ist, werden die Tiere von dem Magneten entfernt und entladen in einem warmen Induktion Kammer mit 100% Sauerstoff gefüllt. Die Tiere werden in einem Kunststoff versiegelten Behältern übertragen und transportiert unter einer BSC. Sie sind an einem warmen zugfreien Käfig gestellt und darf von der Narkose erholen.

2. Multiple-Maus ex vivo Brain Imaging:

Unabhängig von Bewegungsartefakten erreicht feste MR-Bildgebung eine höhere Auflösung als Live-Bildgebung. Hochauflösende, bieten dreidimensionalen Datensätzen maximale Flexibilität bei der Gewinnung quantitativer Informationen und ermöglichen eine automatisierte Bildanalyse. Eine benutzerdefinierte HF-Spule Array wurde für die parallele Erfassung von 16 hochauflösenden MR-Datensätzen von in-Schädel Mäusehirnen in Nacht Scan-Sitzungen fest entwickelt.

Der 16-Coil ex vivo Brain Imaging Array:

Ein custom-built 16-Weichenan Array wurde Bild 16 Proben gleichzeitig erstellt. Dieses Design verbessert die auf einem früheren Prototyp zur Abbildung drei Proben gleichzeitig in einem 60mm einfügen Gradienten eingestellt. Die 8-Gang-Magnetspulen werden über Wunde an den Enden, um eine einheitliche Empfindlichkeit liefern innerhalb von 10% über eine Länge von 26mm und sind individuell im modularen Fächern (Idziak und Haeberlen, 1982) abgeschirmt. Die 16-Spule Fächer sind an einem Rahmen (Abbildung 5), welche die Spulen innerhalb des Gradienten und klemmt es Positionen in Ort mit einem pneumatischen Blase um die Bewegung zu minimieren montiert.

Multiple-Maus ex vivo Bildgebung des Gehirns vor:

1. Öffnen Sie Brustkorb und legen Nadel (oder Sicherheit Winged Infusionsset 25G X 4.3) in den linken Ventrikel des Herzens von einer narkotisierten Maus (durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (150 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) . Schneiden Sie den rechten Vorhof.
2. Transcardiac Perfusion bündig mit 30 mL Raumtemp 1 X PBS + 1 ul / mL Heparin (1000 USP Einheiten / ml) + 2 mM ProHance bei einer Flussrate von ca. 100 ml / Std.
3. Fixation Pass mit 30 mL 4% PFA (Raumtemperatur) + 2 mM ProHance bei 100 ml / Std.
4. Enthaupten und Haut entfernen, Unterkiefer, Ohren, knorpeligen Nasenspitze.
5. Legen restlichen Schädel-Struktur in 4% PFA + 2 mM ProHance Nacht bei 4 ° C.
6. Transfer zum 1X PBS + 0,02% Natriumazid + 2 mM ProHance.
7. Hochauflösende dreidimensionale MRT bei 7 Tesla tritt zwischen 4 Tage und nicht länger als 2,5 Monate nach der Perfusion. Brains sind in einem 16-Kanal-Magnetspule array (Abbildung 5) platziert.
8. Imaging-Parameter lauten wie folgt: schnelle Spin-Echo mit TR 325 ms und einer TEeff von 30 ms, Echo-Zug Länge von 6 mit 4-Durchschnitt. Die endgültigen Bilder haben eine isotrope Auflösung von 32 um (Abbildung 6) und die Scan-Dauer beträgt ca. 12 Stunden.
9. Nach dem Scannen statt des Schädels in 10% Formalin + 2 mM ProHance für die Konservierung.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Die Maus Ladesystem. Die "Be-Array" und "Maus hive" mit einem gemeinsamen Glasfaser Eisenbahnnetz angeschlossen.

Abbildung 2. Die Induktion Kammer.

Abbildung 3. A) Der Schlitten, zeigt eingebettete Sensoren zur Überwachung und Kopfstütze. b) einer narkotisierten Maus auf einem Schlitten mit der Kopfstütze befestigt. Der Schlitten Montage leicht gleitet in die Zentrifugenröhrchen.

Abbildung 4. Vertreter in vivo multiple Hirn-Bilder von einem 3 Stunden dreidimensionalen Scan.

Abbildung 5. 16-Kanal-Magnetspule Array für das Scannen von 16 festen Gehirn Proben.

Abbildung 6. Representative ex-vivo Gehirn Bild.

Diskussion

Sowohl die in vivo und ex vivo-Maus-Imaging-Systeme Bild mehrere Themen auf einmal, um den Durchsatz von bildgebenden Studien deutlich zu erhöhen, ohne eine Erhöhung der Belichtungszeit. Das Gehirn Bilder sowohl aus dem In-vivo-und ex vivo multiple-Maus bildgebenden Verfahren sind von hoher Qualität und eignen sich für Phänotypisierung Dur-und Moll-Strukturen im Gehirn der Maus bzw..

Zur Minimierung Tier Vorbereitungszeit von mehreren Exemplaren, ist die Parallelisierung von Prozessen von entscheidender Bedeutung. Zum Beispiel die Entwicklung der Induktion Kammer für die Induktion von mehreren Proben gleichzeitig erlaubt, und der Schlitten ist die Anwendung der EKG-und Temperaturfühler synchronisiert, während Normungsgremium Positionierung. Darüber hinaus ermöglicht unsere ex vivo Imaging System uns die hohe Auflösung dreidimensionale Bilder von 16 festen ganze Gehirn gleichzeitig die ideal für High-Throughput-Phänotypisierung Studien zu erwerben.

Mögliche Einschränkungen der in-vivo-Imaging-System gehören die Unfähigkeit, individuell steuern Anästhesie und Temperatur für jede Maus. Bei Bedarf individuelle Narkose Steuerung kann mit der Zugabe von exklusiven Anästhesiemittelverdampfer für jede Maus durchgeführt werden. Eine weitere Einschränkung der in-vivo-Bildgebung ist, dass das Scannen an Mäusen, die weniger als etwa 32 Gramm sind beschränkt ist. Allerdings gibt es einen Plan derzeit an der Spule zu vergrößern, um größere Tiere unterzubringen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)	Baxter Internationl Inc.	CA2L9108
NAIR	Church & Dwight Co.
Tears Naturale P.M.	Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)	GE Healthcare	J-110A
Custom Sleds	Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg	Wisent Inc.	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)	Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)	Sigma-Aldrich	P-6148-500g
Sodium Azide	Fisher Scientific	S227-100
Formalin 10%	Fisher Scientific	SF100-4