Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

Zusammenfassung

mStrawberry OP9 Zellen ermöglichen vollständige Bewertung aller ES-derived Nachkommen von Co-Kultur.

Zusammenfassung

Die in vitro Differenzierung von ES-Zellen zu einer hämatopoetischen Zelle Schicksal ist nützlich, wenn das Studium Zellpopulationen, die schwer zu in vivo und zur Charakterisierung der frühesten Gene in Blutbildung beteiligt sind, ohne sich mit embryonalen Letalitäten viel zuzugreifen. Die ES/OP9 Co-Kultur-System wurde ursprünglich entwickelt, um hämatopoetische Nachkommen zu produzieren, ohne über die Produktion von Makrophagen, die OP9 stromalen Zelllinie, die aus der Schädeldecke des Osteopetrose mutierten Mäusen, die funktionelle M-CSF Mangel abgeleitet ist. Die in vitro ES/OP9 Co-Kultur-System kann verwendet werden, um frühzeitig hämatopoetischen Entwicklung rekapitulieren werden. Wenn auf OP9 Stromazellen kultiviert, differenzieren ES-Zellen in Flk-1 + hemangioblasts, hämatopoetischen Vorläuferzellen und schließlich reifen, terminal differenzierten Linien. Die Standard-ES/OP9 Co-Kultur-Protokoll beinhaltet die Vermittlung von ES-Zellen auf eine konfluente Schicht von OP9 Zellen, sowie periodische Neuplattierungen Schritte zur Entfernung alter, verunreinigen OP9 Zellen. Darüber hinaus beinhalten aktuelle Protokolle Auswertung nur die blutbildenden Zellen in Suspension und sind nicht für die Bewertung von ES-derived Nachkommen an jedem Tag der Differenzierung optimiert. Doch mit Neuplattierungen Schritte und die Ernte von nur Suspensionszellen eine potentiell fehlt ein großer Teil der ES-derived Nachkommen und Entwicklung hämatopoetischen Zellen. Dieses Problem wird es wichtig, Adresse wenn man versucht, hämatopoetischen Defekte mit KO-ES-Linien verbunden zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine modifizierte ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur, die für die Beseitigung der Verunreinigung OP9 Zellen aus Downstream-Assays ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die komplette Auswertung aller ES-derived Nachkommen an allen Tagen der Co-Kultur, was zu einer hämatopoetischen Differenzierung Muster, die mehr entspricht direkt der hämatopoetischen Differenzierung Muster innerhalb der Embryo beobachtet.

Protokoll

1. Vorbereitung der ES-Zellen

1. Kultur ES-Zellen nach Standardprotokoll für Ihre speziellen Zell-Linie. Achten Sie darauf, genug ES-Zellen auf den Teller vorzubereiten auf der mStrawberry OP9 Zellen für Tag 0 (ES-Zellen werden auf 1x10 ^ 3 Zellen pro cm ² am Tag 0 beschichtet werden)

2. Vorbereitung der OP9 Zellen

1. Bevor wachsenden mStrawberry OP9 Zellen, bereiten die OP9 Nährmedien
   OP-9 Zellkulturmedium
   

   	Lager	Endkonzentration.	Volumen (ml)
   aMEM			39,5
   FBS (OP-9 getestet)	100%	20%	10
   L-Glutamin	100X (200mm)	2mM	0,5
   			50 mL

   
   Lagerung bei 4 ° C lagern und innerhalb von einer Woche Vorbereitung
2. Um mStrawberry OP9 Zellen zu erhalten, müssen Medien alle 2 Tage und Zellen sollten vor der Zellen zu erreichen Konfluenz (Subkultur bei 70-90% Konfluenz) subkultiviert werden. mStrawberry OP9 Zellkulturen sind nie über 90% Konfluenz gezüchtet, wie diese in ihrer Differenzierung in Adipozyten führt. Siehe Abbildung 3.
   1. Subculture Zellen durch Waschen der Zellen 2X mit PBS (oder 1x mit PBS + 1x 0,1% mit Trypsin-EDTA)
   2. Add vorgewärmten 0,1% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 Minuten (oder bis die Zellen zu lösen)
   3. Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen OP-9 Wachstumsmedium. Transfer-Zellen auf eine 50 ml konischen Rohr.
   4. Pellet-Zellen bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Überstand.
   5. Die Zellen in frischem mStrawberry OP9 Nährmedien
   6. Platte Zellen bei einer Dichte von 10 ⁴ Zellen / cm ²
   7. Wachsen mStrawberry OP9 Zellen bis zur Konfluenz ab 3 Tage vor Tag für Co-Kultivierung ES-Zellen (Tag 0, Tag 5 oder Tag8 / 9 des Experiments) benötigt

3. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur

1. Bereiten Sie Co-Kultur Differenzierung Medien
   

   	Lager	Finale	Volumen (ml)
   aMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-Glutamin	200 mM	2mM	0,5
   			50 mL

2. mStrawberry OP9 Zellen (Tag -3)
   1. IMMER Subculture OP9 Zellen am Tag -3, so dass Sie konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen für Tag 0 der Co-Kultur haben. Siehe Abbildung 4b. Platte mStrawberry OP9 Zellen bei 1x10 ⁴ / cm ² auf Konfluenz am Tag 0. Achten Sie darauf, Subkultur zusätzliche Zellen für Tag 5 und Tag 8 / 9 für die Fortsetzung der Co-Kultur.
3. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur Set-Up (Tag 0)
   1. Wash ES-Zellen 2x mit PBS
   2. Trypsinize ES-Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA, Inkubation 5min bei 37 ° C
   3. Add Co-Kultur Differenzierung Medien Zellen
   4. Pellet ES-Zellen bei 400xg, 5-7min, RT. Überstand
   5. Die Zellen in Co-Kultur Differenzierung Medien
   6. Entfernen Sie das Medium aus mStrawberry OP9 Zellen
   7. Add Co-Kultur Differenzierung Medien mStrawberry OP9 Flaschen
   8. Platte 1x10 ³ ES-Zellen / cm ² bis Flasche mStrawberry OP9 Zellen. Inkubieren Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ mit Feuchtigkeit.
4. mStrawberry OP9 Zellen (Tag 2)
   1. Subculture mStrawberry OP9 so dass Sie konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen für Tag 5 der Co-Kultur. Platte mStrawberry OP9 Zellen bei 1x10 ⁴ / cm ² auf Konfluenz am Tag 5 (wie in Schritt 3,2). Achten Sie darauf, Subkultur zusätzliche Zellen für Day 8 / 9, falls erforderlich (wie in Schritt 2,2).
5. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 3)
   1. Entfernen Sie vorsichtig Medium von Co-Kultur und ersetzen mit frischen Co-Kultur Differenzierungsmedium

6. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 5)

   1. Sorgfältig waschen Co-Kulturen 2x mit PBS
   2. Trypsinize Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Wash-Zellen aus Kolben mit Co-Kultur Differenzierung Medien
   4. Pellet-Zellen bei 400xg, Discard 7min, RT. Überstand
   5. Add Co-Kultur Differenzierung Medien Zellen. Verwenden Sie eine 21-Gauge bluntended Nadel Zellen resuspendieren und für einzelne Zellsuspension gewährleisten
   6. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Sollte 100-150 fachen Anstieg der ES-Zell-Zahl von Tag 0 zu haben.
   7. Re-Seed 6.48x10 ⁴ / cm ² - 7.76x10 ⁴ / cm ² Co-Kultur-Zellen auf eine neue Ebene der konfluent, mStrawberry OP9 Zellen
   8. Tag 5 ASSAYS-Remaining Co-Kultur-Zellen können für die Durchflusszytometrie-Analyse, cytopreps (30K-Zellen), Chip-Assays, etc. verwendet werden
7. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 8 / 9 und Tag 12)
   1. Entfernen Differenzierung Medien von Kolben und speichern. Wash Monoschicht 1x mit PBS, um hämatopoetische Zellen in Suspension zu entfernen. Nicht wegwerfen hämatopoetischen Zellen.
   2. Trypsinize adhärente Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Wash-Zellen aus Kolben mit ES Differenzierung Medien und in den blutbildenden Zellen in Suspension = gefunden
   4. Pellet-Zellen bei 400xg, Discard 7min, RT. Überstand
   5. Add Co-Kultur Differenzierung Medien oder PBS zu den Zellen. Verwenden Sie eine 21-Gauge bluntended Nadel Zellen resuspendieren und für einzelne Zellsuspension Zählen von Zellen mit einer Zählkammer zu gewährleisten.
   6. Co-Kultur kann für 14 Tage fortgesetzt werden, um reifer hämatopoetischer Vorläuferzellen durch erneutes Seeding Co-Kultur-Zellen zu bewerten auf einer neuen Ebene der konfluent, mStrawberry OP9 Zellen an Tag 8 oder 9 und dann wieder am 12. Tag. Re-Seed optimierte Zellzahl auf gewünschte Zelle Erholung für den Tag des Tests basiert.
8. Evaluation von ES-derived Nachkommen (Tag 1-14). ES-derived Nachkommen können an jedem Tag der Co-Kultur von flow Aussortieren mStrawberry negativen Zellen (ES-derived Nachkommen) ausgewertet werden.
   1. Entfernen Differenzierung Medien von Kolben und speichern. Wash Monoschicht 1x mit PBS, um hämatopoetische Zellen in Suspension zu entfernen. Nicht wegwerfen hämatopoetischen Zellen.
   2. Trypsinize adhärente Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Wash-Zellen aus Kolben mit Co-Kultur Differenzierung Medien und in den blutbildenden Zellen in Suspension gefunden
   4. Pellet-Zellen bei 400xg, 7min, RT. Überstand
   5. Die Zellen mit 21-Gauge bluntended Nadel und zählen
   6. ES-derived Nachkommen (mStrawberry negativen Zellen) kann Flow aus mStrawberry positive OP9 Zellen sortiert werden. ES-derived Nachkommen können dann mittels Durchflusszytometrie-Analyse, cytopreps, ChIP-Assays, etc. charakterisiert werden

4. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur-System. Unser Labor verwendet eine in vitro ES-Zell-Co-Kultur Systems zu modellieren hämatopoetischen Entwicklung. In dieser Co-Kultur-System, zu differenzieren ES-Zellen in hemangioblasts am Tag 5, wenn sie auf eine konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen gelegt. Als Co-Kultur geht, sind hämatopoetischen Vorläufer an Tag 8 vorhanden, während terminal differenzierten hämatopoetischen Linien von Tag 14 erscheinen. Die Pfeile zeigen die Tage der Differenzierung bei Passagieren der ES-derived Nachkommen auf neue konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen in notwendig.

Abbildung 2. Proper ES-Zell-Differenzierung. ES-Zellen werden auf eine konfluente Schicht von mStrawberry OP9 am Tag 0 ausgesät. ES-derived Nachkommen beginnen sichtbar zu werden an Tag 3 der Differenzierung, der mit ES-derived Nachkommen aussehen wie eine Ansammlung von Zellen mit einer definierten Grenze oder Anfang an einen Quirl Muster zu bilden. Hemangioblasts, die das gemeinsame mesodermalen Vorläufer für die Endothel-und hämatopoetischen Linien sind, sollte wie bis Quirle von Zellen an Tag 5 angehäuft. Für Co-Kultur Zeiträume von mehr als 5 Tage sollte ES-derived Nachkommen als Cluster von hämatopoetischen Zellen erscheinen. Zwei bis vier celled Cluster, an Tag 6 / 7, erscheinen soll und wachsen in größeren Zellverbänden von Tag 8 / 9 der Co-Kultur. Andere ES abgeleitet Nachkommen finden sich auch fest an die Anhänger Stromazellen Schicht gebunden.

Abbildung 3. Erfolglose ES-Zell-Differenzierung. Die Ergebnisse dieser Co-Kultur widerspiegeln unsachgemäße ES-Zell-Differenzierung. Beachten Sie, wie die ES-derived Nachkommen nicht in einem Quirl Muster am Tag 5 erscheinen. Das Fehlen von Zellen in einem Quirl Muster weist auf unsachgemäße hemangioblast Bildung. Wenn hemangioblast nicht richtig entwickeln zu tun, dann weiter Co-Kultur wird in verkümmerten hämatopoetischen Linie Differenzierung führen. Co-Kulturen mit unsachgemäße hemangioblast Bildung muss verworfen werden.

Abbildung 4. mStrawberry OP9 Zellkulturen. (A) mStrawberry OP9 Zelle sind subkultiviert70-90% Konfluenz. (B) Für eine korrekte Differenzierung, sind ES-Zellen und ES-derived Nachkommen auf einen übermäßig konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen gelegt.

Abbildung 5. Vertreter ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur Strömungsprofil. Alle ES-derived Nachkommen sind mStrawberry negativen Zellen und kann Flow aus der mStrawberry OP9 Zellen sortiert werden. mStrawberry negativen Zelle Tor wurde mit einem traditionellen ES/OP9 Co-Kultur.

Diskussion

Proper Differenzierung von ES-Zellen auf konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen führt zur Produktion von Flk1 + hemangioblasts am Tag 5 der Co-Kultur. Hemangioblasts sollte wie bis Quirle von Zellen, wie in Abbildung 1 beobachtet angehäuft. Für den Rest der Co-Kultur sollte sichtbar ES-derived Nachkommen als Cluster von hämatopoetischen Zellen (Abbildung 1) erscheinen. Am Tag 6 / 7 zwei vor vier Zellhaufen erscheinen soll und wachsen in größeren Zellverbänden (beide haftend und in Suspension) von Day 8 / 9 der Co-Kultur. Andere ES abgeleitet Nachkommen finden sich auch nahtlos in die adhärenten Stromazellen Schicht gebunden.

Obwohl nicht im Protokoll aufgeführt sind, ist es entscheidend, Pre-Test der FBS in der ES Wachstumsmedium, die mStrawberry OP9 Wachstum Medien und die ES / mStrawberry OP9 Differenzierung Medien eingesetzt. Richtig getestet Serum sollte richtiges Wachstum von mStrawberry OP9 Zellen, sowie, korrekte Differenzierung von ES-Zellen in Co-Kultur bis Tag 5 der Differenzierung zu gewährleisten. Als Alternative oder zusätzlich zu mStrawberry OP9 Zellen können OP9 Zellen bestrahlt, bei 8000 rad sein, vor der Aussaat bei Konfluenz (7.8x10 ⁴ Zellen / cm ^2). Die Bestrahlung von Zellen erlaubt OP9 für die Beseitigung der wiederholten Neuplattierungen Schritte, sowie, ermöglicht fast vollständige Beseitigung der alten, verunreinigen OP9 Zellen aus Downstream-Assays.

OP9 Zellen wurden entwickelt, um mStrawberry Protein, das durch Transduktion OP9 Zellen mit 3ug/mL eines lentiviralen Vektor, mStrawberry unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (pRRLsin-CMV-Vektor, UCLA-Vektor-Kern) zu äußern.

Standard ES/OP9 Co-Kultur-Protokolle beinhalten die Vermittlung von ES-Zellen auf eine konfluente Schicht OP9 Zellen, sowie eine Tag 5 Neuplattierungen Schritt zur Reduzierung alt, verunreinigen OP9 Zellen aus Zellpassage. Darüber hinaus sind nur hämatopoetischen Zellen in Suspension gefunden für die Bewertung von ES-derived Nachkommen entfernt. Doch sowohl mit einem Neuplattierungen Schritt und die Ernte von nur Suspensionszellen eine potentiell vermisst eine beträchtliche Anzahl von Entwicklungsländern ES-abgeleitete hämatopoetische Zellen. Dieses Problem wird es wichtig, Adresse wenn man versucht, hämatopoetischen Defekte mit KO-ES-Linien verbunden zu charakterisieren. Um dieses Problem zu umgehen unserem Labor verwendet ein modifiziertes Co-Kultur, durch den Einsatz von mStrawberry-exprimierenden OP9 Zellen. Dadurch ist gewährleistet, dass alle ES Nachkommen der anhaltenden Co-Kultur sind an Tag 5 übertragen, und für die Ernte aller ES-derived Nachkommen für Downstream-Assays. Diese Änderung stellt eine nützliche Tools in der Evaluierung und Charakterisierung von hämatopoetischen Nachkommen von Mensch und Maus-ES-Linien abgeleitet.

Das ES-mStrawberry OP9 Co-Kultur-Modell fasst die verschiedenen Stufen primitive und definitive Hämatopoese. Bei der Untersuchung der frühesten Stadien der hämatopoetischen Entwicklung, nutzen viele Menschen die BL-CFC (Blast-wie koloniebildenden Zellen)-Assay, der die Entwicklung der hemangioblast aus der ES-Zellen zu beurteilen. Während die BL-CFC-Assay ist ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung von frühen hämatopoetischen Entwicklung, weist die mStrawberry-ES Co-Kultur-Systeme zu erhöhen Dienstprogramm, wie es für die Beurteilung der hemangioblast sowie mehr erwachsene hämatopoetischen Linien ermöglicht.

Frühere Arbeiten mit traditionellen OP9/ES und EB Differenzierung Protokolle hat gezeigt, dass zusätzliche Faktoren vielleicht notwendig, wie die Überexpression von HOXB4, um daraus langfristig repopulating hämatopoetischen Stammzellen in vitro. Zusätzliche Arbeit ist zu prüfen, ob mStrawberry negativ, sortiert ES-derived Bevölkerung wahr hämatopoetischen Stammzellen enthalten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Catalog Number	Kommentare
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Omega Scientific	FB01	Pre-Tested
L-Glutamin	CellGro	25 bis 005-CI	200 nM
Trypsin-EDTA	Stem Cell Technologies	07901

Name des Reagenz	Firma	Catalog Number	Kommentare
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Pre-Tested
L-Glutamin	CellGro	25 bis 005-CI	200 mM
PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +)	CellGro	21 bis 031-CV
Trypsin-EDTA	Stem Cell Technologies	07901