Demonstration der Verwendung des neuartigen Gravitationskraft Spectrometer auf Stretch and Measure Faserproteinen

Zusammenfassung

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den Zweck, den Betrieb und repräsentative Ergebnisse aus dem Roman Gravitationskraft Spektrometer.

Zusammenfassung

Das Studium der makromolekularen Struktur hat sich kritisch zur Aufklärung der molekularen Mechanismen und Funktion. Es gibt mehrere begrenzte, aber wichtige Bioinstrumente der Lage, die Prüfung der Kraft Abhängigkeit der strukturellen Merkmale in Proteine. Skala hat eine Begrenzung der Parameter, wie genau können die Forscher in den nanomechanischen Welt der Moleküle, wie Nukleinsäuren, Enzymen und Motor-Proteine, die lebenserhaltende Arbeit zu verrichten Peer worden. Atomic Force Microscopy (AFM) ist gut abgestimmt, um einheimische Strukturen Faserproteinen mit einem Abstand Auflösung auf Augenhöhe mit der Elektronenmikroskopie bestimmen. Doch in AFM-Studien sind die Kräfte in der Regel viel höher als ein einzelnes Molekül kann ^{1, 2} zu erleben. Optische Fallen (OT) sind sehr gut auf die Bestimmung der relative Abstand zwischen den eingeschlossenen Perlen, und sie verleihen können sehr kleine Forces ^3. Allerdings stehen sie nicht nachgeben genaue absolute Länge der Moleküle unter-Studie. Molekulare Simulationen liefern unterstützende Informationen für solche Experimente, sondern in der Fähigkeit, die gleichen großen molekularen Größen, lange Zeiträume, Griff und überzeugen einige Forscher in Ermangelung anderer Belege ^{2, 4} begrenzt.

Die Gravitationskraft Spektrometer (GFS) füllt eine kritische Nische in das Arsenal der Ermittler durch eine einzigartige Kombination von Fähigkeiten. Dieses Instrument ist in der Lage Kräfte in der Regel mit 98% oder eine höhere Genauigkeit bei der femtonewton Bereich der Nanonewton Bereich. Die Abstandsmessungen derzeit sind in der Lage die Lösung der absolute molekulare Länge bis fünf Nanometer, und die relative bead Paar Abstände mit einer Genauigkeit vergleichbar mit einer optischen Falle. Außerdem kann die GFS bestimmen Dehnung oder Abwickeln, wo die Kraft der Nähe des Gleichgewichts ist, oder eine abgestufte Kraft gegen jede gemessene strukturelle Veränderungen gegenüberzustellen. Es ist sogar möglich, festzustellen, wie viele Aminosäuren sind in Abwickeln Veranstaltungen unter physiologischen Kraftbelastungen ² beteiligt. Im Gegensatz zu anderen Methoden, wo es umfangreiche Kraftkalibrierung, dass alle Tests vorausgehen muss, erfordert die GFS keine solche Kraft Kalibrierung ^5. Durch die Ergänzung der Stärken des anderen Methoden wird die GFS Lücken im Verständnis der Nanomechanik lebenswichtiger Proteine ​​und andere Makromoleküle zu überbrücken.

Protokoll

Einführung in die Novel GFS-Konfiguration

Die GFS besteht aus mehreren wesentlichen Komponenten: Eine regelmäßige Lichtmikroskop, eine Montierung, eine Kamera und einen Computer [Abb. 1]. Die versiegelten Flow-Zelle Kammer, die die Probe hält, ist auch nach der GFS-Design unverzichtbar. Das Licht-Mikroskop wird auf die Montierung angebracht, so der Umfang gedreht werden kann, in verschiedene Orientierungen im Raum. Diese Fähigkeit ermöglicht die statische Vektor der Schwerkraft zu nutzen, so dass die Proben können dynamisch orientierte in Bezug auf den Vektor so die Schwerkraft kann Pikonewton-Bereich Kraftbelastungen, um die Proben zu verleihen. Die Kamera ersetzt das Lichtmikroskop der Augenlinse so dass es Veränderungen in der Orientierung der Probe aufzeichnen kann. Diese Rohdaten werden digitalisiert und manipuliert durch den Computer, um die Daten in tatsächliche Gewalt und Abstandsmessungen zu interpretieren. Die versiegelten flow-Kammer ist so konstruiert, um alle Freiheitsgrade im Raum ohne Probenverlust ermöglichen. In der Kammer befindet sich die Probe-Molekül, das in der Nähe eines Terminus mit einem "Anker" bead, dass die Oberfläche der Kammer geklebt ist angebunden. Das Gegenteil Terminus ist eine "mobile" Perle, die frei von der Oberfläche der Kammer gebunden. Es ist diese mobile Perle, frei in der Assay-Puffer, die auf durch die Schwerkraft gehandelt werden kann, dabei die angebundenen Moleküle bei so niedrigen Kraftbelastungen [Abb. 2]. Die Probe sieht einfach wie ein Paar von Mikrosphären unter dem Mikroskop, obwohl es einige Erfahrung dauert eine gute brauchbare Paaren, die durch ihre Bindung an ein Molekül aus Paaren, wo beide Perlen auf der Oberfläche des flow-Kammer sitzen gekoppelt sind zu erkennen. Eine Änderung des Systems ist die Zugabe von einer schwimmenden Plattform, die die GFS hält und wird durch Federn aufgehängt. In dieser Konfiguration, wenn die Probe wurde in eine Position gedreht, wo die Schwerkraft auf die Probe einwirken können, kann die Plattform mit all seinen Komponenten gegen die Federkonstante fallen gelassen werden. Nähe freien Fall, ist die Kraft, die auf dem mobilen Perle nahe Null und bei maximaler Ausdehnung der Federn ", die Gravitationskraft ist so viel wie zwei multipliziert. Auf diese Weise kann eine abgestufte Kraft / Weg-Reaktion grafisch dargestellt, um das Verhalten eines einzelnen Moleküls in verschiedenen Kraftbelastungen messen.

1. Mikrosphärenpräparat

1. Tauchen etwa 10 mg aus Glas oder Quarz Perlen in 0,04% 3-Aminopropyltriethoxysilan (Schnitt mit Aceton) für zwei Minuten.
2. Spülen Sie mit zwei Änderungen doppelt destilliertem Wasser und Zentrifuge Pellet bei 2000 xg für 5 Minuten. Überstand.
3. 5 ml Bindungspuffer (0,01 M Pyridin mit doppelt destilliertem Wasser geschnitten und pH-Wert auf 6,0), und schütteln Sie diese Mischung kräftig. Centrifuge wie oben beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
4. Um nasse Kuchen von Perlen, 2 mL 5% Glutaraldehyd-Lösung (cut Glutaraldehyd mit Kupplungspuffer). Kräftig schütteln.
5. Unter einer Haube, drehen Raupe / Glutaraldehyd-Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur.
6. Centrifuge wie oben und saugen Sie den Überstand.
7. Waschen Sie die Kugeln in 5 ml Bindungspuffer durch Schütteln sie energisch und Zentrifuge und saugen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen noch dreimal.
8. Fügen Sie etwa 15 ul des gewünschten Antikörpers, um Perlen und kräftig schütteln. Die Perlen sollten gedreht 16-24 Stunden sein.
9. Unter der Haube, mit 5 ml 1 M Glycin Abschrecken Lösung (cut Glycin mit doppelt destilliertem Wasser und pH-Wert auf 7,0). Schütteln Sie dieses Gemisch kräftig und drehen für 30 Minuten.
10. Zentrifuge und saugen Sie den Überstand.
11. 5 ml Waschpuffer (0,01 M Tris, pH 7,0, 0,1% Natriumazid, 0,1% BSA; 0,15 M NaCl und 0,001 M EDTA). Schütteln Sie diese kräftig, Zentrifuge und saugen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal wiederholen.
12. Ändern Puffer mit niedrigem Salz-Puffer (0,1 M KCl, 0,02 M Imidazol, 5 mM MgCl _2, auf pH 7,0). Dreimal wiederholen.

2. Beispiel Anlage zum Microspheres

1. Nehmen Sie eine kleine Menge des vorbereiteten Beads (ca. 2 ul von jedem Kuchen von Perlen aber, wenn es eine große Diskrepanz im Durchmesser zwischen den Chargen, ist es vorteilhaft, um einen 8:1-Verhältnis von großen zu kleinen Kügelchen zu verwenden) und fügen Sie sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Assay-Puffer. Reduzieren Sie die Konzentration Ihrer Protein auf rund 5 uM, mit dem Assay-Puffer. Bereiten Sie mindestens ein Gesamtvolumen von 400 ul einschließlich der Puffer, das Protein, und die Perlen.
2. Drehen Sie diese Mischung bei etwa 1 RPM für 3 Stunden (wenn das Protein zu viel bewegt wird, wird es zu aggregieren und unbrauchbar).

3. Slide Chamber Vorbereitung

1. Coat eine dicke Objektträger mit 0,01% Nitrocellulose (in Amylacetat). Lassen Sie dieses Bild trocken für etwa 10 Minuten.
2. Mit einem scharfen Glasschneider, schneiden Deckglas, so dass eine Kammer zu machen. Dies erfordert vier Streifen von Glas.
3. Verwenden Sie die Tatsache,Theorie Rand des Glases und Harke es über ein Abstrich von Vakuum-Fett auf beiden Seiten der Kante.
4. Drücken Sie Fett beschichteten Streifen auf getrocknete Nitrocellulose überdachte Rutschbahn, um ein Feld auf der Oberfläche der Folie zu erstellen.
5. Pipette ca. 2 ul der Raupe / Proteinmischung, indem Pipette auf die Oberfläche des Glases in der Box.
6. Fügen Sie über 20-400 ul der salzarmen Puffer je nachdem wie groß der Kammer ist.
7. Drücken Sie ein Deckglas auf dem Feld, die bereits mit Vakuum-Fett beschichtet, um die versiegelte und gepuffert Kammer zu beenden.
8. Lassen Sie gleiten auf einem ebenen Platz sitzen, so dass die Perlen reichlich Zeit, sich an die Nitrozellulose Anker haben.

4. GFS Data Acquisition

1. Montieren Sie gleiten auf GFS Bühne
2. Monitor, was die GFS Kamera die Aufnahme und die Suche nach legitim ist "Perle Paare", in denen die kleinen Mikrosphären in der Nähe des Äquators der großen Mikrosphären verbunden ist.
3. Wenn ein potentieller bead Paar gefunden wird, durch die Tiefenschärfe zu gehen, um festzustellen, ob die "mobile" Perle nicht ruht auf der Oberfläche der Folie.
4. Sobald ein geeignetes Paar identifiziert wird, wird zur Kenntnis Winkel mobilen Wulst weg von d _max (d _max = der maximale Abstand zwischen den Schwerpunkten der gekoppelten Mikrosphären). Bewegen Sie den Rahmen in die richtige Position, um Video zu erwerben.
5. Der Winkel der Verfahrweg des GFS sollte ausreichen, um d _min, d _max und d _min, die für 25-90 Grad, abhängig von der Länge des Moleküls nennen könnte aufzunehmen.
6. RECORD wie das Paar reist von d _min auf d _max und zurück nach d _min.
7. Es ist eine gute Idee, auch einen Film drehen des Hintergrunds so kann er später für die Analyse abgezogen werden.
8. Wenn der Durchführung einer GFS Drop verschieben Sie den Rahmen wieder auf d _max und notieren Sie die Tropfen bei mindestens 60 Bildern pro Sekunde. Der kritische Teil ist die erste Schwingung, aber lange Aufnahmezeiten können auch für dynamische Untersuchung verwendet werden.

5. GFS Data Analysis

1. Transform raw video in digital "Schwellenwert" Bild-und Makro ausführen in ImageJ zum Zentroid Position jedes Kügelchen in jedem Frame des Videos zu bestimmen. Dies gilt auch für den Rückgang Video.
2. Dump der X-, Y-und Area-Data aus ImageJ in Excel und die Punkte.
3. Wenn eine richtige Perle Paar von Video erworben wurde, ist ein deutlicher Buckel in der Grafik bezeichnend für die Beads an ihren engsten (d _min) und an der Spitze des Graphen ist die Position der d _max.
4. Anhand dieser Daten soll der Radius jedes Kügelchen genau in ImageJ bestimmt werden und alle diese Informationen in die verschachtelte Gleichung ausgedrückt:
   d = [(g sin α) ² + (g cos α + d _max - g) ^{2] 0,5}
   g = [d _min ² + r _b ² - (r _a + r _b) ^{2] 0,5} = r _b sin β
   c = d _max - r _a - g
   (D = Abstand zwischen Schwerpunkte; g = Schwerkraft; α = Winkel in Grad parallel zu dem Objektiv; r _b = Radius der mobilen bead; r _a = Radius verankert Wulst, β = Winkel der Befestigung der Achse des Äquator der Verankerung Wulst.
5. Mit der angepassten Radius des mobilen Wulst, ergibt sich auch das Volumen, und angesichts der Dichte der Kugel, die Kraft des mobilen Perle verleiht dem Molekül kann in Pikonewton nach dem Auftrieb des Lösungsmittels berechnet werden subtrahiert. Bei dieser Methode wird die Kraft auf die angebundenen Moleküle in Pikonewton und berechnet die absolute Molekül Länge zwischen Antikörper-Anhänge in Nanometern. F = V (db) a (F = Kraft, V = Volumen, d = Dichte des Glases Mikrosphären, a = Beschleunigung aufgrund der Schwerkraft, b = die Dichte des verdrängten Wassers).

6. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn die Raupe prep korrekt erfolgt ist, wird es mindestens Bead-Aggregation werden, obwohl es vielleicht noch ein gelegentlicher bead Klumpen werden. Wenn Sie über den Umfang gesehen sollte es eine vernünftige Verteilung der Perlen, ob repariert oder nicht in der Kammer sein.

Es ist wichtig, um Vibrationen so weit wie möglich zu minimieren; diese entweder eine Luft-Tabelle zu tun, spezielle stoßdämpfende Füße für ein Stativ, dass ein EQ Montierung hält, oder auf dem System, Federn für Schwingungsisolierung eingesetzt werden kann nutzt.

Ein weiterer nützlicher Tipp in Bezug auf die versiegelten Flusskammer zu lassen, für etwa fünf Minuten auf einem ebenen Tisch stand, nachdem es vollständig aufgebaut worden. Dies ermöglicht es jedem frei größere Perlen zu schweben nach unten durch den Puffer und Ruhe in der Schicht aus Nitrocellulose. Wenn die Folie wurden stattdessen direkt nach Fertigstellung montiert, würden die Ermittler immer wieder müssen mit Perlen buchstäblich fliegen durch das Sichtfeld viel, und wenn dies geschieht, während der Video-Erfassung kann th korruptene Experiment. Wenn dies richtig gemacht wird, bead Flug deutlich minimiert und sauberer Video Ergebnisse.

Wenn ein potentieller bead Paar von der GFS-Operator identifiziert wird, ist es sinnvoll, sie durch eine vorläufige Rotation versetzt, um das Verhalten des Paares zu überwachen. Selten ist die große Perle nicht fest mit der Folie angebracht. Wenn dies geschieht, gibt es keine Verwendung bei der Nutzung des Paares, weil es entscheidend, dass die größere Perle Aufenthalt in einer festen Position über die Dauer der Übernahme verankert ist. Wenn das Paar ist stabil und weist keine "verankert Wulst rollen," dann ist es geeignet für Experimente.

Ein Grundstück von bead Abstände gegen Änderung des Winkels relativ zur Schwerkraft kann verwendet werden, um die gewonnenen Daten auszuwerten. Ein gutes repräsentatives Ergebnis würde wenig Trennung auf einem Plateau zu zeigen und als mobile Raupe löst sich aus der Verankerung Perle, weil der Einfluss der Schwerkraft, die Grafik wird eine stärkere Trennung zeigen. Dies wird fortgesetzt, bis ein schöner Gipfel ist erreicht, als d _max ist und die Kurve beginnt wieder nach unten zurück zur Grundlinie d _min [Abb. 1]. Unter idealen Bedingungen ist diese Signatur symmetrisch. Ein nicht repräsentatives Ergebnis würde zeigen, ein Diagramm mit unzusammenhängenden Muster zeigt keine deutliche d _{min-d max-d min} Muster, oder wäre es Trennungen, die Größenordnungen zu hoch für ein einzelnes Molekül angibt, vielleicht sind zeigen, dass es war ein Stück von Staub zwischen die Perlen, oder vielleicht, dass das mobile Perle war einfach nicht angebracht überhaupt. Der Prozess des Findens des Paares, Schießen es, zu verarbeiten und zu analysieren hat es viele Stop Lücken, wo falsche Perle Paare gekeult out sind. Also, wenn Sie an das Ende des gesamten Prozesses zu bekommen und Sie haben ein Molekül Länge, die im Einklang mit früheren Ergebnissen ist, kann man sehr zuversichtlich, dass die ursprüngliche Raupe Paar repräsentativ ist und kann in den Ergebnissen enthalten sein. An einem guten Tag können etwa die Hälfte der Raupe Paare Schuss durch genommen werden, um eine legitime Datenpunkt werden. Zum Beispiel ist die Länge der Coiled-Coil von Myosin zwischen MF20 und MF30-Antikörper, basierend auf EM-Daten und AFM-, Daten zu 100 nm ^{2,7,8,9-Ansatz} bekannt. Wenn das Ergebnis ist um ein Vielfaches dieser Länge muss die Probe zusammengefasst. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind aus Standard-GFS-Rotation Experimente und zeigen einen Abstand von 96 nm ± 5 nm, [Abb. 2], die eng stimmt mit den Messungen der MF30 (bindet an den N-Terminus von Myosin Subfragment-2) und MF20 (bindet in das Licht meromyosin) Antikörper Abstand auf Myosin aus der Literatur nicht ableiten [Abbildung 3].

Abbildung 1. GFS-Konfiguration. Wesentliche Teile des GFS gekennzeichnet sind.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des GFS-Prinzip. Die linke Seite zeigt Schwerpunkt der mobilen Raupe mit einem Mindestabstand von Zentroid verankert Wulst. Als GFS gedreht wird, richtet mobilen Perle mit Vektor der Schwerkraft, die auch läuft parallel mit der Achse des angebundenen Molekül. In dieser Position ist der Abstand zwischen den Schwerpunkten der mobilen und verankert Perlen auf ein Maximum. Oben rechts zeigt eine repräsentative Scheibe aus einem GFS Film. Unten rechts ist ein Bild von der GFS unterziehen Rotation.

Abbildung 3 repräsentatives Ergebnis zeigt d _min auf der linken Seite des Diagramms;. D _max bei einer relativen Trennung von 17,78 Mikrometer und eine Rückkehr zu d _min rund um die Grundlinie von rund 17,75 Mikrometer relativen Abstand zwischen den Perlen.

Abbildung 4. Repräsentatives Ergebnis der GFS-Rotation Experiment zeigt Abstand zwischen MF20 und MF30-Antikörper durchschnittlich 96 nm. Dies stellt die ungefähre Länge von S2.

Abbildung 5. Myosin II-Dimer verwendet werden, um eventuellen Anlagen für den Einsatz mit GFS einschließlich Antikörper und / oder Aktin-Anhänge zu zeigen. Verschiedene Befestigungsmöglichkeiten ermöglicht unterschiedliche GFS Strategien verschiedenen Regionen zu messen, oder um Kraft senkrecht an oder parallel zum Stab Domäne des Myosin-Dimer.

Diskussion

Bei der Konvertierung eines Films auf einem digital Schwellenwert Darstellung, ist es entscheidend für den Schwellenwert Bild, um die gleiche Fläche in jedem Frame des Videos zu erhalten. Da die Kügelchen in eine Perle Paar unabhängig voneinander bewegen, kann eine Drift in den Schwellenwert Bereichen auch dazu führen, die relativen Abstände zwischen den Schwerpunkten der Perlen zu treiben und führen zu signifikanten Fehler. Controlling der Schwelle Bereich reduziert den Fehler das Fünffache in die Abstandsmessu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA