Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Zusammenfassung

Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ermöglicht die Detektion von flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), ohne dass für jede Vorbehandlung der Probe. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die schnelle (innerhalb von Minuten) Charakterisierung von bakteriellen VOCs mit SESI-MS.

Zusammenfassung

Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ist eine Methode zum raschen Nachweis von flüchtigen Verbindungen entwickelt, ohne die Notwendigkeit für Probenvorbehandlung. Die Methode wurde zuerst von Fenn und Kollegen ¹ beschrieben und hat den Nachweis von illegalen Drogen ² und Sprengstoff ^3-4, die Charakterisierung der Haut flüchtigen ^5, und die Analyse des Atems ^6-7 angewendet worden.

SESI Ionisation durch Protonen-Transfer-Reaktionen zwischen den Elektrospray-Lösung und die flüchtigen Analyten und ist daher für die Analyse von hetero-organischen Molekülen geeignet, ebenso wie in traditionellen Elektrospray-Ionisation (ESI). Doch im Gegensatz zu Standard-ESI, tritt das Proton-Transfer-Prozess von SESI in der Gasphase statt in Lösung (Abb. 1), und deshalb SESI am besten geeignet ist zur Detektion von organischen flüchtigen und Aerosole.

Wir erweitern den Einsatz von SESI-MS zur Detektion von bakteriellen volatiles als eine Methode zur Identifizierung von Bakterien und Charakterisierung ^8. Wir haben gezeigt, dass SESI-MS flüchtigen Fingerprinting, mit einer statistischen Analyse-Verfahren kombiniert, verwendet werden, um Bakterien-Gattungen, Arten und Mischkulturen in einer Vielzahl von Nährmedien unterscheiden. ⁸ Hier haben wir die Schritte für den Erhalt von bakteriellen flüchtigen Fingerabdrücke mit SESI bieten -MS, darunter die instrumentelle Parameter, die optimiert werden, um robuste Identifizierung von Bakterien und Charakterisierung sicher sein sollte.

Protokoll

Abbildung 1. Schaltplan für SESI-MS-Analyse der bakteriellen volatiles. Der Kopfraum der Bakterienkultur wird durch CO ₂ (1) in die SESI Reaktionskammer (2) verdrängt. Da die flüchtigen durchqueren die SESI Reaktionskammer sie durch die Elektrospray Wolke und ionisiert (3). Einmal ionisiert werden die flüchtigen Bestandteile in das Massenspektrometer für die Analyse (4) gezogen. Überschüssiges Trägergas und umgesetzten bakterielle flüchtigen Stoffe werden durch einen 0,22 um-Filter (5) weitergeleitet, wie ein zusätzliches Maß an Schutz und entlüftet werden, um eine chemische Kapuze. Kleines Bild: Die SESI Elektrospray Nadel ist eine Silica-Kapillare (40 um ID) mit einem geschärften Nadelspitze.

Zur Demonstration des Einsatzes von SESI-MS zur Charakterisierung von bakteriellen volatiles, E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1 sind aerob für 24 h in 50 mL LB-Lennox bei 37 ° C und die SESI-MS-Spektren der Kopfraum flüchtigen Stoffe werden in 2 Minuten gesammelt. Kohlendioxid (99,99%) bei einer Flussrate von 2 L / min wird als Trägergas für flüchtige Auslieferung an die Reaktionskammer verwendet. Die SESI Reaktionskammer wurde speziell gebaut und ausgestattet, um eine API-3000 (SCIEX) als Ersatz für die ursprüngliche Elektrospray-Ionenquelle. Die Spektren sind in Positiv-Ionen-Modus mit 0,1% Ameisensäure, 5,0% Methanol und 94,9% Wasser (v / v) als Elektrospray-Lösung gesammelt, geliefert mit 5 nl / s durch eine nicht leitende Silica-Kapillare mit einem geschärften Nadelspitze (40 um ID). Die angelegte Spannung beträgt 2,5 kV. - 500 Da, MCA-Modus, 40-Scans, 3 s / Scan-und 2 min Gesamtanalyse Zeit 20: Analyst 1.4.2 Software (Applied Biosystems) ist für die Datenerfassung mit den folgenden Parametern verwendet.

1. Anzucht-System

1. Wählen Sie die passende Gefäß für das Wachstum Ihres Kulturen, wenn man bedenkt das Wachstum Anforderungen der Arten in Ihrem Experiment (z. B. Belüftung, Licht, Temperatur, etc.), sowie die effiziente Bereitstellung von flüchtigen dem Massenspektrometer. Die Kultur Flaschen, die wir wählen, zu verwenden sind Standard 100 mL Pyrex Medien-Flaschen mit Schraub-, dass mindestens zwei Luer-Ports ausgestattet. Eine Zuleitung wird durch einen Luer-Anschluss für Trägergas Lieferung an der Probeflasche und eine Ableitung durch einen anderen Anschluss für VOC Lieferung an das Instrument (Abbildung 1) eingesetzt ist. Jede zusätzliche Ports angeschlossen sind.
2. Vor Kultivierung der Proben, unter Druck die Gefäße und in Wasser tauchen, um auf Dichtigkeit prüfen. Gaslecks sind eine Hauptursache für atypische Ergebnisse in Form von schwach oder nicht vorhanden flüchtigen Ionen-Signale.

2. Biologische Experimente: set-up-und Sicherheitsüberlegungen

1. Steigern Sie Ihre Kulturen in den geeigneten Bedingungen, um Ihre Hypothese. Es wird empfohlen, mindestens zwei biologische, Wiederholungen mit jeweils zwei technischen Replikaten, sind für jede Variable verwendet.
2. Bereiten Sie eine leere für jede Kultur Zustand (mittel, Antibiotika, etc.) und inkubieren Sie die leere unter den gleichen Bedingungen wie Ihre Proben.
3. Beschäftigen Sicherheitsvorkehrungen, die für die biologische Arbeitsstoffe Sie verwenden werden, unter Berücksichtigung der biologischen Sicherheit (s) der Arten.
4. Um zu verhindern Kontamination von Ihrem Instrument und das Gas Transferstraßen mit lebensfähigen biologischen Agenzien, installieren Filter der entsprechenden Porengröße in den Träger Gasleitung. Die Filter werden nicht mit der Übertragung von flüchtigen, die SESI Reaktionskammer stören, können aber etwas Einfluss auf die Effizienz der Aerosol-Übertragung. ⁶
5. Verwenden Sie Auffangbecken oder Biosicherheitswerkbank beim Anbringen des Gases Übertragungskappe Ihre Kultur Flasche auf die richtige Containment im Falle von Verschütten biologischen Arbeitsstoffen zu gewährleisten.
6. Einleitung und Beendigung von Trägergasstrom Ihre Probeflasche in einer Weise, die nicht bauen steigt der Druck in der Flasche.

3. Instrument Optimierung

HINWEIS: SESI-MS speziell auf Probe flüchtigen ausgelegt, so schränken die Verwendung von duftenden Körperpflegeprodukten (zB Kölnisch Wasser, Mundwasser, Lotionen, Weichspüler), Gummi, Zigaretten, etc. vor Gebrauch des Instruments. Fest verschließen alle flüchtigen Chemikalien im Labor, und die Kontrolle Zugluft so weit wie möglich während der Prüfung.

Die folgende instrumentelle Parameter, die alle betreffen Signalintensität und Stabilität, müssen Sie für Ihr Instrument und Experiment optimiert werden.

1. Elektrospray-Lösung und Durchfluss: Wählen Sie die passende Elektrospray Lösung für die Klasse von Molekülen gewünschten Ziel, unter Berücksichtigung der operativen Instrument Polarität (positiv oder negativ-Ionen-Modus) und molekularen Charakter der Zielverbindungen. In diesem Versuch wurde die Elektrospray-Lösung 0,1% Ameisensäure, 5,0% Methanol, 94,9% Wasser (v / v), der das Signal Intensität von weniger polaren Molekülen erhöht while eine gute Stabilität des Signals. Die Lösung ist bei einer Flussrate von 5 nl / s. geliefert
2. Gasstrom: Der Gasstrom kann die Elektrospray Stabilität und die Signalintensität beeinflussen. CO ₂ (≥ 99,99%) bei einer Flussrate von 2 l / min zum Einsatz.
3. Needle Form und Funktion: Die Nadelspitze Form und Position stark auf die Signalintensität und Stabilität. Bei der Installation einer neuen Nadel, muss die Position der Nadel optimiert, um eine Balance zwischen geringem Hintergrund, hohe Analyt-Signal Intensität und Stabilität des Signals zu erzeugen. Um SESI Spektren nach einer Nadel ändern zu reproduzieren, ist es notwendig, in regelmäßigen Abständen zu sammeln Spektren, wie Sie die Nadel zu verstellen, bis Sie in der Lage, das beobachtete Spektrum, um Ihre Daten passen. Die Entfernung von Elektrospray Nadelspitze Massenspektrometrie Öffnung wird 1 - 5 mm.
4. Angelegte Spannung: Die Spannung, die auf das System angewendet wird, betrifft das Signal Ionenintensität und die Stabilität der Elektrospray Taylor Kegel. Darüber hinaus ist die optimale Spannung abhängig von Ihrem Elektrospray-Lösung und die Nadelspitze zu gestalten. Zu Beginn Ihrer Reihe von Experimenten, bestimmen Sie die Spannung, die die optimale Bandbreite und Stabilität des Signals ergibt sich für Ihr System und verwenden Sie dann diese Spannung für alle nachfolgenden Experimente. Für unser System angelegten Spannungen von 2,0 - 5,0 kV bieten optimale Signalstärke und Elektrospray Stabilität. Für dieses Experiment 2,5 kV verwendet wird.

4. Einschalten und Einstellen des SESI-MS für die Analyse

1. Beginnen Sie, indem sichergestellt wird, dass die Spannungsversorgung ausgeschaltet ist und dass das System der Elektrizität entladen. Tun Sie dies, indem 1) die Gewährleistung der Anzeige leuchtet die Spannungsversorgung abgeschaltet, 2) die Gewährleistung der Spannung auf dem Multimeter Null ist, und 3) die Erdung der elektrischen Leitungen.
2. Installieren Sie die entsprechende Elektrospray-Lösung für Ihr Experiment.
3. Schalten Sie das Trägergas und stellen Sie den Strom, um die Rate für Ihr Experiment.
4. Druck auf die Elektrospray Reservoir zur Lieferung der Elektrospray-Lösung in die Reaktionskammer zu initiieren.
5. Schalten Sie die Spannungsversorgung und die Spannung auf einen entsprechenden Wert für Ihre Experimente.

HINWEIS: An dieser Stelle der Metalloberflächen der Ionisierungsquelle der Lage sind, liefern eine gefährliche Schock. Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Arbeit rund um das Instrument, wenn die Spannungsversorgung eingeschaltet worden ist.

6. Richten Sie ein Tuning-Verfahren zur Überwachung der SESI-MS-Spektrum während Sie fein abgestimmte Anpassungen der angelegten Spannung. Verwenden Sie die Aufnahme-Parameter, die Sie für Ihr System und Ihre Experiment optimiert. Deaktivieren Sie das Multiple Channel Acquisition (MCA) Kontrollkästchen (falls zutreffend), so dass jeder Scan eine unabhängige Spektrum erzeugt, stellen Sie die Aufnahmezeit auf 10 bis 15 min, und starten Sie die Übernahme. Spectra des Trägergases Hintergrund sollte nun beobachtet werden.
7. Machen Feinabstimmung Anpassungen der angelegten Spannung zu einer stabilen Gesamtrendite (TIC) und reproduzierbare Scans, dass die CO _2-Scans für Ihre früheren Experimenten überein zu erhalten. Sobald die Spannung Anpassungen vorgenommen wurden, weiterhin Spektren und TIC für fünf Minuten, um sicherzustellen, das Instrument stabilisiert zu sammeln.
8. Sobald instrumental Stabilität gewährleistet ist, bis der Erwerbsmethode entsprechend Ihrer Proben gesetzt, die Anpassung der Messzeit, Datenbereich und MCA Auswahl nach Bedarf. Sammeln Sie ein Trägergas Hintergrund Spektrum für Ihre Unterlagen.

5. Die Erteilung einer flüchtigen Fingerabdruck Ihrer Bakterienkultur

1. Zum Sammeln ein leeres Spektrum, direkt das Trägergas durchströmt den Bypass-Leitungen, und fügen Sie die Blindprobe (Ventile geschlossen), um das Gas Transferstraßen des Instruments.
2. Öffnen Sie die Ventile, um die Probe-Flasche, und schließen Sie die Ventile der Bypass-Leitungen.
3. Lassen Sie das System für 30 Sekunden ausgleichen, während welcher Zeit die Feuchtigkeit in der Reaktionskammer stabilisiert. Diese Zeit der Äquilibrierung ist unerlässlich für den Erhalt von reproduzierbaren Spektren. Um sicherzustellen, dass das System äquilibriert ist, möchten Sie vielleicht die TIC, die während der Aquilibrierungsperiode Änderung überwachen und stabilisieren danach.
4. Sobald das System äquilibriert, initiieren Spektrum Sammlung.
5. Nach dem Spektrum gesammelt, entfernen Sie die Probeflasche von dem ersten Öffnen des Trägergases Bypass-Leitungen, dann schließt die Probe Ventile, und schließlich der Entnahme der Probe Flasche. Spülen Sie das System mit dem Trägergas für 2 bis 4 min, das Entfernen der Feuchtigkeit und adsorbierten flüchtigen Stoffen aus dem Transferstraßen, Verhinderung von Probe zu Probe Verschleppung.
6. Wiederholen Sie die Schritte 5,2 bis 5,5 für jede bakterielle Probe intermittierend Erfassung zusätzlicher Leerspektren einer gründlichen blank Subtraktion zu gewährleisten. Unvollständige blank Subtraktion wird die FührungAussehen der chemischen Hintergrund Gipfel in Ihre verarbeitet Spektrum, die für Atmosphärendruck-Ionisation Techniken (z. B. Phthalate, Silikone, etc.). ⁹
7. Bei der Erhebung Ihrer Spektren, sicherzustellen, dass die Ionen-Signale werden nicht mehr als die lineare Nachweisgrenzen des Instruments, wie die TIC und die maximale Intensität der einzelnen Peaks ermitteln. Ionen Überschreiten des oberen Grenzen Ihres Instruments Detektor erzeugen kann Artefakt Peaks, die nicht repräsentativ sind Ihrer Probe.

6. Repräsentative Ergebnisse

Als ein Beispiel für die SESI-MS-Spektren, die für bakterielle volatiles, die positive Ionen-Modus flüchtigen Fingerabdrücke für E. erhältlich coli und P. aeruginosa aerob in LB-Lennox für 24 h gezüchtet bei 37 ° C angezeigt (Abb. 2). Die E. coli flüchtigen Spektrum von Indol bei m / z = 118 dominiert, gibt die E. coli Kulturen ihre charakteristischen Geruch, während das Spektrum von P. aeruginosa enthält eine größere Vielfalt an protonierbare Gipfel.

Bitte beachten Sie, dass die relativen Intensitäten der Peaks in den flüchtigen Spektrum abhängig von der instrumentalen Parameter in Abschnitt 3 beschrieben werden. Diese Parameter müssen dicht von Experiment zu Experiment kontrolliert werden, um reproduzierbare Spektren zu erhalten.

Abbildung 2 Blank-subtrahiert positive Ionen-Modus SESI-MS-Spektren (20 bis 150 m / z). E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1 volatiles nach 24 h aeroben Wachstumsbedingungen in LB-Lennox bei 37 ° C. Für weitere Informationen über die Gipfel in der SESI Spektren entnehmen Sie bitte Zhu et al. ^8.

Diskussion

Bakterien produzieren verschiedene Kombinationen von flüchtigen, die Identifizierung von Bakterien ^10-12 und die Beurteilung der Stoffwechsellage eingesetzt werden können. Die SESI-MS hier beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, schnell Charakterisierung bakterieller volatiles (in zwei Minuten oder weniger) ohne Probenvorbereitung, Erzeugen einer bakteriellen "Fingerabdruck" zur Identifizierung der Arten. ⁸ In den letzten Jahrzehnten andere Atmosphärendruck-Ionisation MS-Techniken haben zur Charakterisierung von flüchtigen Verbindungen, einschließlich selektiver Ionen Strömungsrohr (SIFT) und Proton-Transfer-Reaktion (PTR)-Massenspektrometrie angewendet worden. Der markante Vorteil, dass SESI bietet gegenüber diesen anderen Ionisation-Methoden ist, dass es möglich Fragment spezifischen Peaks (vorausgesetzt, die geeignete Art von Massenspektrometer für SESI angepasst), die ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Substanzen ist. Wir haben nicht auf Spitzenzeiten Fragmentierung im Protokoll aufgeführten, aber Beispiele dafür, wie Fragmentierung Informationen finden Sie in der Charakterisierung von bakteriellen flüchtigen verwendet werden, entnehmen Sie bitte Zhu et al. ⁸

SESI-MS hat die direkte Anwendung auf die in-situ-Detektion von bakteriellen Infektionen der Lunge über Atem-Analyse, sondern kann auch eine andere Einstellung, in der flüchtige Probenahme ist möglich angewendet werden. Zum Beispiel die Analyse von flüchtigen Stoffen im Urin, Blut und Atem, die relevant für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen, sind Magen-Darm-Erkrankungen, Krebs, und der Umwelt gegenüber, gut zu SESI-MS geeignet. ^13,14 SESI-MS hat auch ein breites Spektrum von nicht-klinischen VOC-Fingerprinting-Anwendungen, einschließlich schnelle Analyse von Lebensmitteln, die für die charakteristische flüchtige mit Reifung, Alterung oder Verderb verbunden. ^15-18

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Typ	Firma	Katalog #	Kommentar
API-3000 Triple-Quadrupol-	Instrument	SCIEX		Gekauft mit Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI Ion Source	Instrument			Custom-made; Siehe Referenz 6
Gas-Durchflussmesser	Ausstattung	Cole-Parmer	EW-03217-74
Kohlendioxid	Ausstattung	Airgas	CD I300	≥ 99,99% reinem
Stickstoff	Ausstattung	Airgas	NI UHP300	Hochreine
100 ml Glas Medien Flaschen	Ausstattung	VWR	89012-114	GL45-Gewinde
Flaschenverschlüsse mit Luer-Anschlüsse	Ausstattung	Bio Chem Fluidics	00945T-3	Cap Montage
Luer-Anschluss-Stecker	Ausstattung	Bio Chem Fluidics	009LP	Cap Montage
Tubing 1 / 4 "(OD) x 1 / 8" (ID)	Ausstattung	Cole-Parmer	EW-95875-02	Cap Montage-und Gas-Transferstraßen
Tubing 1 / 8 "(OD) x 1 / 16" (ID)	Ausstattung	Cole-Parmer	EW-06605-27	Cap Montage
Zwei-Wege-Ventile	Ausstattung	Cole-Parmer	07391-04	Cap Montage
Filter, Grade AAQ	Ausstattung	Balston Filter	9922-05
Ameisensäure, LC / MS grade	Reagens	Fischer	A117-05AMP	Elektrospray-Lösung
Methanol, LC / MS grade	Reagens	Fischer	A456-500	Elektrospray-Lösung
Wasser, LC / MS grade	Reagens	Fischer	W6-500	Elektrospray-Lösung