Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Method Article
Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.
Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Protein zu identifizieren: Chromatin-Wechselwirkungen, die im Kontext von lebenden Zellen 1-3 auftreten. Diese Technik wurde in großem Umfang in Gewebekulturzellen ausgebeutet und in geringerem Maße, in primärem Gewebe. Die Anwendung des ChIP mit Nagetier-embryonalen Gewebe, insbesondere in den frühen Zeiten der Entwicklung ist durch die begrenzte Menge an Gewebe und die Heterogenität der Zell-und Gewebetypen des Embryos kompliziert. Hier präsentieren wir eine Methode, um ChIP durchführen mit einem dissoziierten Embryonaltag 8,5 (E8.5) Embryo. Geschert Chromatin aus einem einzigen Embryo E8.5 können unterteilt werden in bis zu fünf Portionen, die die Ermittler genügend Material ermöglicht Kontrollen und für die Untersuchung von spezifischen Protein: Chromatin-Wechselwirkungen.
Wir haben diese Technik genutzt, um zu beginnen, um Protein-Dokument: Chromatin-Wechselwirkungen bei der Spezifikation von Gewebe-spezifischen Genexpression Programme. Die Heterogenität der Zelltypen im Embryo notwendig schränkt die Anwendung dieser Technik, weil das Ergebnis ist der Nachweis von Protein: Chromatin-Wechselwirkungen ohne Unterscheidung, ob die Wechselwirkungen treten in allen, eine Teilmenge von oder einem Zelltyp (s). Allerdings ist die Untersuchung von Gewebe-spezifischer Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Genexpression möglich aus zwei Gründen. Zunächst Immunpräzipitation von gewebespezifischen Faktoren nicht unbedingt isoliert Chromatin aus dem Zelltyp, wo der Faktor ausgedrückt. Zweitens sollte Immunpräzipitation von Ko-Aktivatoren und Histonen mit post-translationale Modifikationen, die mit Gen-Aktivierung assoziiert sind nur bei Genen und Genprodukten regulatorische Sequenzen in die Zelle Typ, bei dem das Gen wird gefunden werden oder wurde aktiviert. Die Technik sollte für das Studium der meisten Gewebe-spezifische Genaktivierung Veranstaltungen.
Im Beispiel unten beschrieben, verwendeten wir E8.5 und E9.5 Maus-Embryonen zu Faktor Bindung an ein Skelettmuskel spezifischen Gen-Promotor zu untersuchen. Somiten, die eine Vorstufe Gewebe, aus denen die Skelettmuskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen bilden, sind an E8.5-9.5 4,5 präsentieren. Myogenin ist ein regulierender Faktor für die Skelettmuskulatur Differenzierung 6-9 erforderlich. Die Daten zeigen, dass Myogenin mit seinen eigenen Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Da Myogenin ist nur in Somiten in diesem Stadium der Entwicklung 6,10 ausgedrückt, zeigen die Daten, die Myogenin Interaktionen mit ihren eigenen Promotor haben bereits in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen in E8.5 Embryonen aufgetreten.
1. Isolierung von Embryonen
Hinweis: Sämtliche Geschäfte mit Mäusen sollten in Übereinstimmung mit den entsprechenden Tierpflege und Nutzungsrichtlinien und Protokolle durchgeführt werden
2. Homogenisierung der isolierten Embryo
3. Cross-Link Chromatin
4. Beschallung
5. Pre-Clearing-und Immunpräzipitation
6. Das Waschen des Chromatin-Protein-Bead-Komplex
Puffer 1: Low Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen.
Buffer 2: High Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen.
Buffer 3: LiCl Salz Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0,25 M LiCl und 1% Desoxycholsäure (Natriumsalz)), 1 ml x 1 zu waschen.
Buffer 4: TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 Wäschen.
7. Die Elution der Chromatin-Antikörper-Komplex
8. Reverse-Cross-Link und Recover DNA
9. Die Analyse der DNA Recovered
10. Repräsentative Ergebnisse
Wir haben dieses Protokoll verwendet, um ChIP von beiden E8.5 und E9.5 Embryonen (Abbildung 2) durchzuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin auf dem Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen ist. ChIP gereinigt DNAs wurden durch konventionelle PCR (Abbildung 2A) und durch quantitative real-time PCR (Abbildung 2B) analysiert. Im Gegensatz dazu gab es keine Anzeichen von Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in den Dottersack, wo Myogenin nicht exprimiert wird. Die Interferon-γ (IFN &ggr;)-Promotor, die Sequenzen passend zum Myogenin Bindungsstelle enthält, wurde als negative Ablaufsteuerung eingesetzt. Wie erwartet, war Myogenin nicht auf die IFNy Promotor in jeder der Gewebeproben getestet gebunden. , Die die Vorläufer der Skelettmuskulatur sind; In E8.5 und 9,5 Embryonen ist Myogenin speziell in den Somiten (6,10 Abb. 3) ausgedrückt. So die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin die Myogenin Promotor in der Somiten bei E8.5 und E9.5 gebunden ist.
Abbildung 1. E8.5 Embryonen Dissektion. (A) Isolierte Uterushorn (oben; höherer Vergrößerung im unteren Bereich, gezeigt). (B) Uterushorn mit einer Schere schneiden auch auf individuellen Nidationsstellen mit einzelnen Embryonen zu trennen. (C) Embryonen ragt aus uterine Gewebe während der Präparation. Pfeile markieren Embryonen noch von extra-embryonalen Gewebe bedeckt. (D) Zwei E8.5 Embryonen aus dem gleichen Wurf. Der Embryo auf der linken Seite hat nicht den Prozess der Umwandlung begonnen. Der Embryo auf der rechten Seite wird derzeit dreht. Ganz rechts - Vertreter E9.5 Embryonen.
Abbildung 2. ChIP-Assay demonstriert Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen. (Top) Konventionelle PCR-Analyse von 5 ul der DNA von Chip-Experimente mit einem Myogenin Antikörper oder unspezifische IgG wurde mit Primern, die einen Teil der Myogenin Förderer von -79 bis +69 relativ zum Start der Transkription verstärken durchgeführt gereinigt, dass enthält eine Myogenin Bindungsstelle bei -12 oder Primer, dass ein Teil der IFNy Promotor, der eine Sequenz passend zum Myogenin Bindungsstelle befindet ~ 1075 bp stromaufwärts von der Transkriptions-Startstelle enthält verstärken entfernt. Die IFNy Primersequenzen verwendet wurden 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'und 5'-TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC-3'. (Bottom) Quantitative Real-time PCR-Analyse der gleichen Proben in (A) verwendet. DieStandardabweichung - Daten werden als% des Eingangs + / aufgetragen.
Abbildung 3. Myogenin ist speziell in den Somiten von E8.5 und E9.5 Embryonen geäußert. Whole mount in situ Hybridisierung von Myogenin zeigt spezifische mRNA-Expression in den Somiten. Größe bar in E8.5 Bild - 200 um. Größe bar in E9.5 Bild - 500 um.
In der beschriebenen ChIP-Protokoll zeigen wir, dass die myogene Regler Myogenin mit dem Myogenin Promotor in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen Gewebe in einzelne E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Frühere Studien haben ausführlich Myogenin Bindung an E-Box enthält Sequenzen aus, beginnend mit dem ersten in vitro Gel-Shift-Experimente unter Verwendung in vitro übersetzt oder bakteriell produzierten Myogenin und radioaktiv markierten DNA-Codierung der relevante Teil der Zielgen regulatorisc...
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 GM56244 zu ANI, die Gelder durch den American Recovery and Reinvestment Act of 2009 ausgezeichnet umfasst, und durch den NIH R01 GM87130 zu Jarp
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten