Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Zusammenfassung

Wir zeigen in dem Video ein Verfahren zur Herstellung einer mittleren Zerebralarterie in erwachsenen Mäusen mit einem intraluminalen Monofilament. Wir zeigen auch, wie man das Ausmaß der Hirninfarkt von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung zu bewerten.

Zusammenfassung

Der Schlaganfall ist die häufigste tödlich verlaufende neurologische Erkrankung in den USA ^1. Die Mehrzahl der Schlaganfälle (88%) resultieren aus Verstopfung von Blutgefäßen im Gehirn (ischämischer Schlaganfall) ^2. Da die meisten ischämischen Schlaganfälle (~ 80%) in das Gebiet der mittleren Hirnarterie (MCA) ³ auftreten, haben viele Tier-Takt Modelle, die entwickelt wurden auf dieser Arterie konzentriert. Die intraluminale Monofilament Modell der mittleren Hirnarterie Okklusion (MCAO) beinhaltet das Einführen eines chirurgischen Fadens in die Arteria carotis externa und Gewindeschneiden es vorwärts in die Arteria carotis interna (ICA), bis die Spitze verschließt die Herkunft des MCA, was zu einer Einstellung des Blutflusses und der anschließenden Hirn-Infarkt in der MCA Gebiet ^4. Die Technik kann verwendet werden, um dauerhafte oder vorübergehende Okklusion ⁵ Modell sein. Wenn die Naht nach einer gewissen Zeit (30 min, 1 h oder 2 h) entfernt wird, wird Reperfusion erreicht (transient MCAO), wenn der Faden belassen wird (24 h) das Verfahren ist als Modell für dauerhafte MCAO geeignet . Diese Technik erfordert keine Kraniektomie, eine neurochirurgische Verfahren, um einen Teil des Schädels, der Hirndruck und Temperatur ⁶ beeinflussen können, zu entfernen. Es ist das am häufigsten verwendete Methode zur dauerhaften und transienter fokaler zerebraler Ischämie bei Ratten und Mäusen ^7,8 imitieren. Zur Beurteilung der Umfang der Hirninfarkt, Flecken wir Hirnschnitten mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) an ischämischen Gehirn Gewebe ⁹ zu identifizieren. In diesem Video zeigen wir die MCAO Methode und die Bestimmung der Infarktgröße durch TTC-Färbung.

Protokoll

1. MCAO Methode

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der UCSF und Kent State University und hält sich an die National Institutes of Health Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren verabschiedet.

1. Schneiden Sie eine 5-0 Naht (Harvard Apparatus, Holliston, MA) in 20 mm-Segmente. Rund um die Spitze jedes Segment durch Erhitzen in der Nähe eines cauterizer (Braintree Scientific, Inc., Boston, MA). Messen Sie den Durchmesser der Spitze mit einem Mikrometer (Applied Image Inc., Rochester, NY). Wir verwenden eine Naht mit einem letzten Tipp Durchmesser von 0,21-0,22 mm für eine Maus mit einem Körpergewicht von 25-30 g.
2. Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren (mindestens 121 ° C, 15 PSI, für 15 min). Sanitize dem OP-Tisch und zugehörige Ausrüstung mit 70% Ethanol.
3. Anesthetize ein 8-12 Wochen alten Maus (25-30 g) mit 5% Isofluran (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) in 30% O ₂ / 70% N ₂ O mit dem V-10 Anästhesie-System (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Nach Einleitung der Narkose, reduzieren Sie die Ebene von Isofluran und halten sie auf 1,5%.
4. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem Heizkissen. Legen Sie eine rektale Sonde und überwachen und pflegen Körpertemperatur zwischen 36,5-37,5 ° C mit dem TR-200 homeothermic Temperatur-System (Fine Science Tools Inc., Foster City, CA).
5. Shave das Fell auf der Bauchseite Halsbereich mit elektrischen Haarschneider (Braintree Scientific) auf die Haut setzen. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit drei Anwendungen von 70% Ethanol.
6. Unter einem Stereo-Binokular (Nikon, Japan), eine 1 cm lange Inzision in der Mittellinie auf den Hals. Verwenden Sie Retraktoren (Braintree Scientific) auf das Operationsfeld freizulegen und Identifizierung der richtigen A. carotis communis (CCA), A. carotis externa (ECA) und A. carotis interna (ICA). Sorgfältig sezieren die Arterien frei von umliegenden Nerven und Bindegewebe.
7. Präparieren Sie die ECA weiter distal und koagulieren die ECA und ihre Arteria thyreoidea superior (STA) Zweig mit einer bipolaren Koagulator (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Schneiden Sie die ECA und STA am koagulierten Segment.
8. Lose Binden Sie zwei 8-0 Seidenfäden um die ECA Stumpf. Tragen Sie einen Gefäßklemme (Fine Science Tools) an der Bifurkation der CCA in die ECA und ICA.
9. Machen Sie einen kleinen Schnitt am Ende der ECA Stumpf mit Vannas Stil Frühling Schere (Fine Science Tools). Messen und notieren Sie die Länge einer 5-0 Naht an der Spitze abgerundet. Legen Sie die Naht in der Einschnitt, und führen Sie die Klemme. Ziehen Sie die beiden Seidennähte um das Lumen gerade genug, um sichere und dennoch bewahren Mobilität der in-Wohnung monofilen Naht.
10. Entfernen Sie die Klammer von der Bifurkation. Gently Voraus das Monofil Faden aus dem Lumen des ECA in die ICA für eine Entfernung von 9-10 mm über der Bifurkation der CCA, den Ursprung der MCA verschließen. Die Dauer der Operation beträgt ca. 30-45 min.
11. Suture der Schnitt am Hals und die Maus in einem 35 ° C Pflege Feld aus der Narkose zu erholen, und sendet es an den Käfig. Es dauert in der Regel 5-10 min für die Mäuse von der Narkose erholen. Um transiente MCAO, kann der Forscher wieder betäuben der Maus und ziehen Sie den Faden wieder in den Stumpf des ECA nach einer Zeit, in der Regel zwischen 0,5 bis 2 h.
12. Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion von MCAO, betäuben die Maus mit 5% Isofluran und euthanize es durch Genickbruch. Köpfen der Maus und sammle das Gehirn. Scheiben des Gehirns koronal in vier 2-mm-Scheiben mit einem Gehirn-Matrix (Braintree Scientific) auf Eis. Inkubieren Sie die Hirnschnitten in 2% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (Sigma-Aldrich) in 1X PBS für 20 min bei Raumtemperatur, um die Größe und das Ausmaß des Infarkts zu bestimmen. Befestigen Sie den Hirnschnitten in 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung (Sigma-Aldrich) bei 4 ° C bis Bildgebung. Das Ausmaß des Infarktes kann quantifiziert werden, da in JoVE Protokoll 955 (beschrieben werden https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) ^9.

2. Repräsentative Ergebnisse

Die Infarkte durch MCAO erzeugt werden in das Striatum und der dorsolateralen Kortex gesehen. Das Striatum ist empfindlicher gegenüber Ischämie als die Großhirnrinde. Dreißig Minuten MCAO produzieren einen Infarkt nur im Striatum, während mehr als einer Stunde MCAO sowohl Striatum und Kortex beschädigt wird. Nach 24 h permanent MCAO, ist die gesamte Infarkt Anteil ~ 40 ± 5% der Hemisphäre und die Sterblichkeitsrate nach einer Operation ist ~ 10%. Wir schließen Mäuse aus weiteren Studien, wenn übermäßige Blutungen während der Operation, die Betriebszeit 90 min überschreitet, nicht Mäuse von der Narkose innerhalb von 15 min zu erholen, oder Blutung im Gehirn Scheiben oder an der Basis der Kreis der Willis während Autopsie gefunden .

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Abbildung 1. Repräsentative Bilder TTC-gefärbten Hirnschnitten (koronalen Ebene 1-4) nach 24 h permanent MCAO. In lebendem Gewebe TTC wird enzymatisch durch Dehydrogenasen zu 1,3,5-Triphenylformazan (TPF), die in der Farbe rot wird reduziert, während in nekrotischen Gebieten ist es weiß bleibt wegen des Fehlens einer solchen enzymatischen Aktivität. Daher kann der Bereich der Infarkt durch seine weiße Farbe wegen mangelnder Umsetzung der TTC auf TPF identifiziert werden. Hinweis: TTC ist etwas Wärme und Licht instabil, so schützen gefärbten Schnitten von Wärme und Licht so weit wie möglich.

Diskussion

MCAO in Mäusen wird häufig verwendet, um Schwerpunkte Hirnischämie in Menschen-Modell. Verwendung von Mäusen für Schlaganfall-Studien häufiger geworden, weil die Verfügbarkeit von transgenen und Knockout-Stämme. Es gibt ein paar wichtige Details in der Protokollnotiz:

1. Es ist wichtig, um die Maus Körpertemperatur während der Operation zu erhalten und, bevor es vollständig erholt aus der Narkose. Die Körpertemperatur hat Auswirkungen auf das Ausmaß des Infarktes; Unterkühlung abnimmt und Hyperthermie erhöht die Größe des Infarkts.
2. Während Entlarvung und Isolierung der CCA und ECA, um eine Beschädigung der Nähe Vagusnerv und Luftröhre, die Infarktgröße und Abnahme Lebensfähigkeit erhöhen könnte.
3. Stecken Sie niemals das Monofilament Naht mehr als 10 mm fallen die Bifurkation. Eine Naht eingefügt zu weit kann perforieren die A. cerebri anterior und das Ergebnis in Hirnblutung. Ein Widerstand zu spüren, wenn die Naht etwa 9-10 mm über der Bifurkation Punkt vorangetrieben werden. Wenn dies geschieht, sollte der Forscher stoppen Förderung der Naht und bestätigen die Ferne.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011