Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Zusammenfassung

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Zusammenfassung

Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation.

Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen 'forward-scatter' Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.

Protokoll

1. Harvesting von Geweben

1. Bereiten Röhrchen mit 2 bis 5 ml kaltem Färbepuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 0,2% BSA und 5 mM Glucose). Keep Röhrchen auf Eis vor der Gewebe zu ernten.
2. Cull Mäusen nach geeigneten genehmigten Protokoll (z. B. CO _2-Inhalation durch Genickbruch folgte).
3. Draw Blut durch Herzpunktion in EDTA-oder Heparin-Blut-Sammlung Rohre für eine spätere Analyse, z. B. von Hämatokrit, Retikulozyten oder CBC-Analyse.
4. Ernte der Milz und Knochen, indem Gewebe aus jeder Maus in ein separates Röhrchen, die in Schritt 1 vorbereitet. Einfacher Zugang zu Milz ist von der linken Seite. Für das Knochenmark, die Ernte eines oder beider Oberschenkel. Keep geerntet Gewebe auf Eis.
5. Wenn gewünscht, wiegen die Milz. Mäuse Einwirkung einer Erythropoetin-Stress-Reaktion geeignet sind, einen signifikanten Anstieg in Milzgewicht zeigen.

2. Vorbereitung von Milzzellen

1. Mit einem vorbefeuchtete 3 ml Spritzenkolben, schieben Sie die Milz, oder ein Teil der Milz (idealerweise 0,1 Gramm oder weniger, das entspricht ungefähr 10 ⁸ Zellen) durch ein 40 um sterile Zellsieb (Fisherbrand Katalog-Nummer 22363547 oder andere) platziert auf einem 50 ml konischen Rohr. Halten Sie das Röhrchen auf Eis während dieses Vorgangs. Waschen Sie die Zellen durch das Sieb mit einer Gesamtfläche von 2 ml Färbepuffer.
2. Gently Pipette die angespannte Zellsuspension aufzubrechen jede kleine Klumpen. Falls erforderlich, erneut belasten die Zellen.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und in kaltem Puffer resuspendieren.
4. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind 1-2 x 10 ⁸ Zellen / Milz. Für Durchflusszytometrie-Analyse, aliquot 1 bis 2.000.000 Zellen pro Probe, entweder in FACS Färbung Röhrchen (BD Falcon Polystyrol Rundboden-Röhrchen, 352008) oder U-Boden 96-Well-Platte (BD Falcon 353910). Beispiel Färbung Volumen 200 ul, um eine endgültige Zellkonzentration von 0,5 bis 1 x 10 ⁷ Zellen / ml oder 1-2 x 10 ⁶ Zellen / 200 ul Probe.

3. Vorbereitung von Knochenmarkzellen

1. Bereiten Sie 1 oder 3 ml Spritzen mit einem angehängten 26G Nadel, mit kaltem Färbepuffer vorgefüllt.
2. Entfernen Sie Muskeln, die an den Oberschenkelknochen, so dass der Knochen deutlich sichtbar zu machen.
3. Mit scharfen chirurgischen Schere, schneiden Sie beide Enden des Oberschenkelknochens, so nah wie möglich an den Enden der Knochen. Dies sollte ein kleines Loch an jeder abgeschnittene Ende zeigen, was in das Knochenmark Hohlraum, der durch die Länge des Oberschenkelknochens läuft.
4. Mit dem Fertigspritzen in Schritt 1 Führen Sie die Nadel durch eines dieser Löcher, und sanft spülen das Knochenmark durch das Loch am anderen Ende, in ein Rohr.
5. Dissoziieren die gespülten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, und durch ein 40 um Sieb für die Milz vor (siehe Abschnitt 2.1).
6. Wash Zellen zweimal durch Zentrifugation in kalten Färbepuffer
7. Zählen Sie die Zellen und Zellen, wie in Abschnitt 2.4. Typische Ausbeuten sind ungefähr 10 ⁷ Zellen pro Femur.

4. Vorbereitung der fötalen Leberzellen

1. Zur Vorbereitung timed-trächtigen weiblichen Mäusen, Einrichten Mäusen zur Paarung in den Abend, zu untersuchen auf Vaginalpfropf vor 10 Uhr des folgenden Tages, der Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird als Tag 0,5. Veterinary Mitarbeiter können möglicherweise Ermittler, die nicht mit dieser Technik, um schwangere Frauen zu identifizieren, zu unterstützen. Eine Schwangerschaft kann auch durch die Überwachung der Maus Gewicht bestimmt werden.
2. Timed-schwangeren weiblichen Mäusen werden an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Schwangerschaft getötet. Die Uterushörner in eine Petri-Schale mit eiskaltem Kulturmedium oder Färbepuffer entfernt.
3. Die Embryonen werden von jedem Gebärmutter entfernt und die fetale Leber präpariert. Ein Binokular ist für Embryonaltag 12,5 (E12.5) oder jünger erforderlich.
4. Livers kann getrennt werden mechanisch durch Pipettieren in Puffer und werden entweder einzeln in 96-Well-Platten verarbeitet, oder zusammen, je nach experimentellen Anforderungen zusammengefasst.
5. Eine fetale Leber bei E13.5 hat ~ 10 ⁷ Zellen. Die Zellen werden zweimal in Färbepuffer gewaschen und bei 1-2 x 10 ⁶ Zellen / 200 ul Probe für die durchflusszytometrische Analyse.

5. Antikörper-Färbung für die Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie eine primäre Antikörper-Färbung Pre-Mix für alle Proben verwendet werden, mit Ausnahme von Kontrollproben, mit folgendem Inhalt:
   • ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), bis zu einer Endkonzentration von 200μg/ml. Prüfen Sie die Lager-Konzentration auf der Flasche (es kann variieren). Dies wird verwendet, um Fc-Rezeptoren in Zellen der Maus blockieren; alternative Arten, die dafür verwendet werden können, sind IgG-oder Ratten-IgG. Species Wahl wird durch die mögliche Anwesenheit in der Färbung Protokoll sekundäre Antikörper gegen primäre Ratte / Maus / Kaninchen-Antikörper, in welchem ​​Fall diese Arten nicht verwenden können gerichtet bestimmtd als blockierende Antikörper. Alternativ können 5% Kaninchenserum auch anstelle von gereinigtem IgG verwendet werden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmente an der Maus Fc-Rezeptoren gerichtet. Das grundlegende Protokoll unten enthält keine Sekundärantikörper und so IgG von jeder der drei Arten verwendet werden kann.
   • CD71-FITC, verdünnt 1:200 (stock 0,5-Promillegrenze, BD-Biosciences, 553266)
   • TER119-PE, 1:200 (Lager 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) verdünnt
   • Jede weitere Antikörper an der Oberfläche Epitope von Interesse gerichtet, z. B. Antikörper an Fas oder FasL (siehe ^1,2) gerichtet. Mix der Antikörper-Lösung vorsichtig durch Invertieren des Röhrchens 2-3 mal.
2. Add 200 ul der Pre-Mix für jede Zelle Probe und sanft wieder aussetzen Zellen.
3. Bereiten Kontrolle Zellproben wie folgt:
   • "Ungefärbte ': Diese Zellen sind in Färbepuffer links und bilden den Hintergrund Autofluoreszenz der Zellen.
   • 'Single color' steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das verwendete Protokoll benötigt. Die Zellen in dieser Kontrollen sind entweder mit einem direkt konjugierten Primärantikörper gefärbt, oder sowohl mit einem primären Antikörper und einem konjugierten sekundären Antikörper. Diese Kontrollen dienen dazu, für die spektrale Überlappung zwischen den Kanälen zu korrigieren.
   • "Fluorescence minus eins" (FMO) steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das Protokoll erforderlich: die Zellen werden mit allen Farben / Antikörper in das Protokoll mit Ausnahme der Farbe gefärbt / Antikörper, bei denen dies der FMO-Steuerung. Die FMO-Steuerung für einen bestimmten Kanal bietet den wahren Hintergrund für diesen Kanal. Es können auch nicht-spezifische Antikörper der gleichen Isotyp und konjugiert mit der gleichen Fluoreszenz-Markierung wie der Test Antikörper (Isotyp-Kontrolle).
4. Inkubieren Proben und entsprechende Kontrollen in den primären Antikörper auf Eis Fleck für 45 'bis 1 Stunde im Dunkeln (put Alufolie abdecken auf Eis-Eimer).
5. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml Färbepuffer jedem Probenröhrchen und Spin für 3 'bis 5' bei etwa 400 xg bei 4 ° C. Bei Verwendung von 96-Well-Platten, waschen Sie die Zellen dreimal in einem Volumen von 200 ul.
6. Wenn relevant, gelten sekundären Antikörper-Färbung. Übernehmen und waschen wie für den ersten Antikörper-Färbung.
7. Gegebenenfalls ist ein Fleck mit Annexin V am Ende der Inkubationszeit aufgetragen, mit einem HEPES-Puffer, wie in der Anleitung des Herstellers. Dieser Fleck ist für 15 Minuten bei Raumtemperatur angewendet, oder für 1 Stunde auf Eis.
8. Die Zellen sind für die Durchflusszytometrie-Analyse in Färbelösung mit einem Zell-undurchlässige DNA-Farbstoff resuspendiert, um tote Zellen auszuschließen. Mehrere DNA-Farbstoffe sind verfügbar, einschließlich Propidiumiodid, 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) oder DAPI. Die Wahl aus den Reihen dieser hängt von der verfügbaren Kanäle, da die Kanäle für spezifische Antikörper-Färbung genommen und Kanälen auf dem Durchflusszytometer. 7AAD von BD-Biosciences (559925) gewonnen und nach den Anweisungen des Herstellers. Für DAPI-Färbung, einen Bestand von 1mg/ml in Dimethylformamid (DMF) aus Pulver (Roche, Kat. Nr. 236276), halten bei -20 ° C und verdünnt 1:10.000 bis 1:15.000 in Färbepuffer.

6. Durchflusszytometrische Sortierung

1. Die Zellen werden mit Antikörpern gegen CD71, TER119, Abstammung Marker und eine Lebensfähigkeit Farbstoff als für durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 5) beschrieben gekennzeichnet. Zellkonzentration während Kennzeichnung kann auf 5 erhöht werden x 10 ⁷ / ml.
2. Mix ein gleiches Volumen an jedem der folgenden Antikörper an die Linie Master-Mix zu machen:
   • FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848
   • FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
   • FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
   • FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
   • FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
   • Verwenden Sie die Master-Mix auf 1:80 (Dies ist gleichbedeutend mit 1:400 Verdünnung der einzelnen Antikörper Bestände, die alle 0,5 mg / ml sind).
3. Verwenden Niederdruck-Sortier-Bedingungen und große Düsen. Für die Aria (BD Biosciences) Wir verwenden 100 μ Düse, 20 psi Druck.
4. Sammlung Puffer: PBS mit Zusatz von 20% Fetal Bovine Serum.
5. Zur Überprüfung der Reinheit der sortierten Populationen, erneut eine kleine Teilmenge von jeder Probe in einem Puffer, der eine Lebensfähigkeit Farbstoff enthält (7AAD oder ähnliches).

7. Repräsentative Ergebnisse:

CD71/Ter119 Färbung der erwachsenen Knochenmark oder Milz identifiziert eine Entwicklungsstörung Sequenz von vier Untergruppen, etikettiert ProE, Erya, EryB und EryC (Abbildung ¹⁾ 1. Morphologisch sind diese zunehmend reifen Erythroblasten entsprechen. Abbildung 1 zeigt die Gating-Sequenz an der Datenanalyse Bühne, die sehr kleine Veranstaltung (einschließlich Kerne, roten Blutkörperchen), aggregierten Zellen und tote Zellen verworfen.

Expression von Zelloberflächen-Proteine ​​können gleichzeitig für jede dieser Teilmengen gemessen werden, indem die entsprechenden Antikörper zur gleichen Zeit wie TER119 und CD71 Färbung. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel von Zell-Oberflächen-Expression des Todes-Rezeptor Fas ^1. Diese Messung wurde in Mäusen mit Epo gespritzt durchgeführt oder in Kontroll-Mäusen mit Kochsalzlösung injiziert. Es ist offensichtlich, dass Epo Fas Ausdruck unterdrückt in der Erya Bevölkerung in vivo ^1.

Expression von intrazellulären Proteinen oder Zellzyklus-Status kann auch für die Zellen in jeder Teilmenge gemessen werden. Abbildung 2 zeigt repräsentative Zellzyklus-Analyse von frisch geernteten Knochenmarkszellen. Diese Messungen erfordern neben Zelloberflächenfärbung mit CD71 und TER119, die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für den intrazellulären Kennzeichnung (siehe Diskussion Abschnitt).

In fetale Leber, sind nicht-erythroiden Zellen zuerst durch Gating auf "Lin-" Zellen, die negativ sind für CD41, Mac-1, Gr-1, B220 und CD3 (Abbildung 3) ausgeschlossen. Die restlichen Zellen sind unterteilt in 6 Teilmengen, S0 bis S5. Die genaue Muster der Zellen in der fötalen Leber ist abhängig von embryonalen Alter (siehe Diskussion Abschnitt). Ein Vertreter des Zellzyklus Analyse der S3 Teilmenge in E13.5 fetale Leber wird angezeigt (Abbildung 4).

Abbildung 1 Die CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Mäusemilz A. Gating-Strategie:.. Milzzellen wurden verarbeitet und gekennzeichnet mit Antikörpern an CD71, TER119 und Fas gerichtet. Diese Abbildung zeigt die Analyse-Strategie nach der Datenerfassung fort. Histogramm I zeigt alle erfassten Ereignisse. Die Diagonale Tor repräsentiert Ereignisse, die wahrscheinlich einzigen Zellen, ohne Dubletten oder größere Aggregate werden. Cells in diesem Tor sind weitere in Histogramm II analysiert. Hier sehr kleine Veranstaltungen, wahrscheinlich Kerne oder Schmutz sind ausgeschlossen. Die gated Zellen werden in Histogramm III, wo DAPI-positive Zellen, die wahrscheinlich sind membranpermeabel apoptotischen Zellen, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden angezeigt. Histogramm IV zeigt die resultierende Population von lebensfähigen Milzzellen. Die ProE Tor enthält CD71 ^hohen TER119 ^{intermediären} Zellen. TER119 ^hohen Zellen werden weiter in Histogramm analysiert V. Hier CD71 ^hohen Zellen in weniger reifen, großen 'Erya "Erythroblasten (CD71 ^hohen TER119 ^hohen FSC ^hoch) und kleiner, reifer' EryB" Erythroblasten (CD71 ^hohen TER119 ^hohen FSC ^niedrig) unterteilt . Die reifsten Erythroblasten Teilmenge EryC (CD71 ^niedrigen TER119 ^hohen FSC ^low). Histogramm VI zeigt Zelloberflächen-Fas Ausdruck, insbesondere in den Erya Teilmenge, bei Mäusen in den Grundzustand (Injektion von Kochsalzlösung) und Mäuse, die mit einer Einzeldosis von Epo gespritzt. Die Färbung mit Fas-Antikörper wurde gleichzeitig mit der CD71/Ter119 Färbung durchgeführt. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich in Liu et al., Blood. 2006 Jul 1, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9.

Abbildung 2. Zellzyklus-Analyse von CD71 ^hohen TER119 ^hohen Erythroblasten im Knochenmark der Maus. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit BrdU injiziert und Milz oder Knochenmark wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert und abgesehen davon, dass für CD71 und TER119 gebeizt, wurden BrdU-Einbau in die DNA-Replikation mit einem monoklonalen Antikörper an BrdU gerichtet gefärbt (Fixierung, Permeabilisierung und BrdU-Färbung Protokoll wurde nach Herstellerangaben). BrdU-positive Zellen in S-Phase des Zyklus. Interphase-Zellen sind BrdU-negative und kann in G1 oder G2 / M Phasen gelöst werden, mit dem DNA-Farbstoff 7AAD.

Abbildung 3 CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Maus fetale Leber A. Gating-Strategie:.. Fötalen Leberzellen wurden für CD71, TER119 beschriftet und ein Cocktail von FITC-markierter Antikörper bei nicht-erythroiden Linie Marker ("Lin") inszeniert. Lebensfähige Zellen (7AAD-negativ) wurden für Lin Ausdruck analysiert und die Lin-Zellen werden weiter in die S0 bis S5 erythroiden Teilmengen unterteilt. Jüngere, ist E13 fetale Leber von weniger reifen Erythroblasten, die durch das Fehlen von Zellen in den reifen S4/S5 Teilmengen gezeigt zusammen. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Abbildung 4. Zellzyklus-Analyse der fötalen Leber erythroiden Teilmengen. Schwangere Mäuse wurden mit BrdU injiziert und fötalen Lebern wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet fixiert, permeabilisiert und gefärbt mit Antikörpern gegen CD71, TER119 und BrdU. Zellzyklus-Status der S3-Zellen gezeigt.

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Diskussion

Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper ³ und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolier...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Fas-Biotin	BD Pharmingen	554256
Streptavidin-APC	Molecular Probes	S868
40 um sterile Zellsieb	Fisherbrand	22363547
Polystyrol Rundboden-Röhrchen für FACS-Färbung	BD Falcon	352008
U-Boden 96-Well-Platte	BD Falcon	353910
ChromePure Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (stock 0,5-Promillegrenze)	BD-Biosciences	553266
TER119-PE (stock 0.2mg/ml)	BD-Biosciences	553673
7AAD	BD-Biosciences	559925
DAPI Pulver	Roche	236276
FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2	BD Pharmingen	553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Pharmingen	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU Flow Kit	BD Pharmingen	557892
Annexin V-Biotin	BD Pharmingen	556418