Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

Zusammenfassung

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Zusammenfassung

Während Metastasierung von Krebszellen aus dem Primärtumor zu verbreiten, in das umgebende Gewebe einzudringen, und die Ausbreitung auf entfernte Organe. Metastasierung ist ein komplexer Prozess, der viele Gewebetypen, span variable Zeiträume betreffen, können und treten oft tief in Organen, wodurch es schwierig zu untersuchen und zu quantifizieren. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit des metastatischen Prozesses von mehreren Schritten in den metastatischen Kaskade macht es schwierig, den Beitrag eines einzelnen Aspekt der Tumorzelle Verhalten zu bewerten beeinflusst. Als Folge davon sind Metastasen Assays häufig in Versuchstieren durchgeführt, um eine unbedingt realistischen Kontext, in dem Metastasen Studie zur Verfügung. Leider sind diese Modelle durch ihre komplexen Physiologie kompliziert. Der Hühnerembryo ist ein einzigartiges In-vivo-Modell, das viele Beschränkungen überwindet, um das Studium Metastasierung, wegen der Erreichbarkeit der Chorioallantoismembran (CAM), einem gut durchbluteten extra-embryonalen Gewebe unter der Eierschale, die empfänglich für die xenografting von Tumorzellen befindet (Abbildung 1). Da darüber hinaus die Hühnerembryo natürlich immundefizienten ist die CAM leicht unterstützt die Transplantation von Normal-und Tumorgewebe. Am wichtigsten ist, die aviäre CAM erfolgreich unterstützt die meisten Krebszellen Eigenschaften wie Wachstum, Invasion, Angiogenese und Umbau der Mikroumgebung. Dies macht das Modell besonders nützlich für die Untersuchung der Signalwege, die zu Krebs Metastasen führen und die Reaktion von metastasierendem Krebs, neue potenzielle Therapeutika vorherzusagen. Der Nachweis von disseminierten Zellen durch artspezifische Alu-PCR ermöglicht die quantitative Erfassung Metastasen in Organen, die durch so wenig wie 25 Zellen besiedelt sind. Mit dem Human Epidermoidkarzinom Zelllinie (HEp3) verwenden wir dieses Modell zur spontanen Metastasierung von Krebszellen in entfernte Organe, wie das Küken Leber und Lunge zu analysieren. Zusätzlich hatte der Alu-PCR-Protokoll zeigen wir die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests als Instrument zur Analyse und Quantifizierung intravasation, Verhaftung, Extravasation und Kolonisierung als einzelne Elemente der Metastasierung.

Protokoll

1. Vorbereitung der Eier für xenografting (spontane Metastasierung)

1. Frisch gelegt befruchtete Hühnereier sind in einer sich drehenden Inkubator für 10 Tage bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Eier gedreht werden viermal pro Stunde.
2. Auf Entwicklungsstörungen Tag 10 werden die Eier auf ihrer Seite in einem Ei Rack platziert. Ein Schwanenhals-Lampe oder einem anderen geeigneten Lichtquelle dient zur Kerze die Eier durch leuchtendes Licht in der Eierschale am stumpfen Ende des Eis, wo die airsac befindet.
3. Die chorioallantoic Vene liegt und markiert. Diese Ader ist an der Spitze der Eierschale, wo es ist Knotenpunkt mehrerer großer Blutgefäße entfernt. An diesem Knotenpunkt des Blutgefäßes fällt nach unten, weg von der CAM und misst an der Embryo. Ein 1cm quadratischer Kasten ist mit Bleistift auf der Eierschale ca. 1 cm entfernt von der Verzweigung in die Vene gezogen. Der Bereich darunter und um den Platz wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in Jod getränkten.
4. Mit einem rotierenden Schneidwerkzeug (Dremel) mit einem Silikon-Karbid Schleifstein (Dremel Teil # 84922) ein Loch durch den stumpfen Ende des Eis in die Luft sac gebohrt ausgestattet. Mit diesem gleichen Werkzeug ein Loch in der zuvor gezeichneten Quadrat auf der Oberseite des Ei gebohrt, stoppen kurz der Eierschale Membran. Ein 25-Gauge-Kanüle mit einem feinen Bohrer am Ende wird verwendet, um ein kleines Loch in der Eierschale Membran man aufpassen, nicht auf die zugrunde liegende CAM reißen zu machen. Die CAM wird anschließend aus der Eierschale Membran im Bereich des Platzes mit sanftem Sog mit einer automatischen Pipette Hilfe mit einem Stück ¼ "Tygon-Schlauch gegen das Loch in der airsac platziert ausgestattet erstellt abgelöst. Nach abgesaugt, sollte ein Luftpolster unter dem Loch auf dem Platz bedeutet, dass die CAM wurde erfolgreich entfernt von der Eierschale gesunken. Nach dem CAM fallen gelassen wird, ist das Loch in der Luftsack und das Loch auf dem Platz in der Nähe des chorioallantoic Vene liegt mit einem Stück Klebeband Labor Klebeband versiegelt. Die Eier werden anschließend in einer stationären Inkubator bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit gestellt in der Erwartung der Transplantation der Tumorzellen. Siehe Abbildung 1 für eine sequentielle Darstellung.

2. Vorbereitung der Eier für die intravenöse Injektion (experimentelle Metastasierung)

1. Frisch gelegt befruchtete Hühnereier sind in einer sich drehenden Inkubator für 12 Tage bei 100 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Eier gedreht werden viermal pro Stunde.
2. Auf Entwicklungsstörungen Tag 12 werden die Eier auf ihrer Seite in einem Ei Rack platziert. Ein Schwanenhals-Lampe oder einem anderen geeigneten Lichtquelle dient zur Kerze die Eier durch leuchtendes Licht in der Eierschale am stumpfen Ende des Eis, wo die airsac befindet.
3. Die chorioallantoic Vene liegt und markiert. Ein 1cm um 0,5 cm Rechteck wird mit Bleistift auf der Eierschale direkt über die Vene gezogen. Der Bereich darunter und um den Platz wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in Jod getränkten.
4. Ein kleines Fenster ist in der Eierschale in der gezeichneten Lage mit dem Dremmel Bohrer (Nr. 118) erstellt. Das Fenster wird entfernt, um die zugrunde liegenden Eierschale Membran, die anschließend gerendert wird transparent mit Tropfen Mineralöl aussetzen. Siehe Abbildung 5A für eine grafische Darstellung.
5. An dieser Stelle das Loch in der Luftsack und das Loch auf dem Platz in der Nähe des chorioallantoic Vene liegt mit einem Stück Klebeband Labor Klebeband versiegelt. Die Eier werden anschließend in einer stationären Inkubator bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit gestellt in der Erwartung der Injektion der Tumorzellen.

3. Vorbereitung Tumorzellen für die Transplantation oder Injektion.

1. Für xenografting, werden die Tumorzellen von ihrer Kulturschalen mit Trypsin / EDTA abgelöst und gewaschen mit 10 Volumen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), um restliches Medium, Trypsin oder EDTA zu entfernen.
2. Für IV Injektion werden kultivierten Zellen abgelöst durch enzymatische Zell-Dissoziation Lösung gewaschen und mit serumfreiem DMEM. und)
3. Die Zellen werden mit einem Hämacytometer gezählt und in PBS bei 10-40 Mio. Zellen / ml für die Transplantation, oder alternativ in serumfreiem DMEM auf 1 Mio. Zellen / ml für iv Injektion resuspendiert.

4. Grafting die Tumorzellen auf die neu freigelegten CAM (Spontane Metastase)

1. Die Eier werden aus dem Brutschrank entnommen und in einem kleinen Fenster wird in die Lage der zuvor gezeichneten Platz, wo die neue Luftblase gebildet hat geschnitten. Dies geschieht am einfachsten mit einem rotierenden Werkzeug mit einer Trennscheibe (Dremel-Tool mit der Nr. 409 kreisförmige Trennscheibe) ausgestattet getan. Ein Paar von Nadel-Nase Zange wird verwendet, um den kleinen Teil der Eierschale zu entfernen und legen das darunterliegende CAM.
2. Mit einem Wattestäbchen (Fisher Brand # 23-400-001) die CAM ist 5 mal abgeschliffen. Ein wenig Blut soll auf der Baumwolle evident. Unmittelbar nach Beschädigung der CAM ist 25 &mgr; l der Zellsuspension auf die beschädigte Stelle platziert. Die optimale Anzahl der Zellen bestimmt empirically kann aber von 0.5X10 ⁵ bis 1x10 ^6-Bereich. Die Fenster in das Ei fest mit Klebeband versiegelt und die Küken stehen gelassen für 10-15 Minuten, damit die Zellen zu begleichen. Nach 15 Minuten werden die Eier mit dem stationären Inkubator zurückgegeben.
3. Die Tumoren dürfen für 5-8 Tage, abhängig von der jeweiligen Anwendung und der Art der Tumor-Zelllinie verwendet werden. Siehe Abbildung 1 für eine sequentielle Darstellung.

5. Die intravenöse Injektion von Tumorzellen (Experimental Metastase)

1. Mit einer 30-Gauge-Insulinspritze 100 &mgr; Zellsuspension wird in die Allantois Vene jedes Embryos injiziert wurde, wurden die Eier mit einer stationären Inkubator zurück und blieb dort für eine zusätzliche 1-7 Tage.
2. An verschiedenen Zeitpunkten werden die Lungen-oder unteren CAM von jedem Embryo geerntet und für den Nachweis von Tumorzellen, wie unten beschrieben.

6. Harvesting Tumoren und chick Gewebe

1. A-Dissektion Gebiet vorbereitet wird. Der Test erkennt metastatischen Zellen durch Quantifizierung menschlicher DNA mit Hilfe eines hochempfindlichen PCR-Ansatz. Es ist daher sehr wichtig, um die Kontamination mit exogenen DNA zu verhindern. Dissektionen sind in einem speziellen Bereich durchgeführt und in der gesamten Dissektionen sind die Werkzeuge zwischen den einzelnen Tieren gereinigt. Ein Satz zum Schneiden das Ei, ein Satz zur Entfernung des Primärtumors und ein Satz für die Entfernung der inneren Organe: Um eine Kreuzkontamination von Proben oder während der Dissektion Prozess 3 separate Gruppen von Werkzeugen verwendet werden zu verhindern. Darüber hinaus sind vier waschen Behälter für sequentielle Spülen von Werkzeugen zwischen den einzelnen Tieren verwendet. In Folge dieser Waschungen sind: 1) doppelt destilliertes Wasser, 2) doppelt destilliertes Wasser, 3) Chlorbleiche, und 4) 70% Ethanol.
2. Die Eier werden von der stationären Inkubator entnommen und auf Eis für 15 Minuten zu betäuben und einschläfern der Tiere. Die Fenster sind geöffnet, so dass die Tumoren sichtbar werden. Das Öffnen der Fenster größer, indem einige der Eierschale kann notwendig sein. Die primären Tumoren sind von der CAM reseziert, gewogen und verarbeitet für die Histologie.
3. Das Küken aus der Eischale, indem man die Schale radial in gleiche Hälften entfernt. Der Embryo ist vom Schnitt Shell dekantiert und in einen sauberen wiegen Boot Brust nach oben. Das Tier ist mit mit einem frischen, sauberen Satz von Werkzeugen zerlegt. Das Tier ist durch einen Schnitt durch das Brustbein eröffnet. Sobald der Embryo ist offen, ein Stück von der Leber aus der rechten oder linken Lappen gesammelt. Die inneren Organe werden anschließend durch leichtes Ziehen an der Speiseröhre an der Muskelmagen und Schneiden der visera, dass die Organe verbinden entfernt. Um zu sammeln Lunge geschnitten wird der Brustkorb eröffnet die Brust Platte getrennt wird und das Herz wird entfernt. An dieser Stelle ist es möglich, rund um die vier Seiten der Lunge Schnitt (oben am nächsten an der Spitze der linken Seite entlang des Brustkorbs, der Boden in der Nähe des Zwerchfells und der rechten Seite entlang der Luftröhre). Aus Gründen der Konsistenz ist die gleiche Lunge in jedes Tier erhoben. Geerntet Gewebeproben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert oder sofort für die DNA-Isolierung weiterverarbeitet werden.

7. Genomic DNA Isolation und quantitative PCR-Analyse

1. Genomische DNA aus Geweben mit dem SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit (Sigma-Aldrich Katalog Nr. XNATRG) extrahiert. Die extrahierte DNA kann auf eine saubere Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -20 ° C oder sofort verwendet. Es ist wichtig, um die DNA 1:50 in Nuklease freiem Wasser verdünnt, bevor Sie es in der anschließenden PCR-Reaktion. Alternativ können DNA extrahiert mit einer beliebigen Anzahl von Standard-DNA-Extraktion-Protokolle (Zijlstra et al., 2002).
2. Menschliche DNA ist in das Küken Gewebe mittels quantitativer PCR spezifisch für humane Alu-Sequenzen erkannt werden. Quantitative PCR mit Alu-spezifischen Primer erfolgt mit dem SYBR green Verstärkung aus der Exract-N-Amp-Kit. Die PCR-Kit kommt mit einem 2x Reaktionsmischung mit SYBR green, Puffer, Salze dNTPs, Taq-Polymerase und die Jumpstart Taq Antikörper. Die Reaktionsmischung wird in einem Endvolumen von 15μl, mit 0.4μM von jedem Primer. Für die meisten Instanzen mit der extrahierten DNA 1:50 wird quantitative Daten zu liefern, jedoch kann die optimale Menge an Template-DNA müssen empirisch optimiert werden. Huhn GAPDH Primer sind als interne Kontrolle der PCR unter folgenden Bedingungen für die Alu-Sequenzen ausgeführt wird verwendet: Polymerase-Aktivierung bei 95 ° C für 2 min von 30 Zyklen bei 95 ° C für 30 s., 63 ° C für 30 s. , 72 ° C für 30 s. Die Reaktionsbedingungen für Hühner GAPDH sind identisch mit denen für Alu beschrieben, jedoch kann es erforderlich sein, um die PCR zu 40 Zyklen erstrecken.
3. Quantitative Analyse von Metastasen erfolgt mit dem ΔΔCt Methode vergleicht experimentelle Gruppen zu einer Kontrollgruppe (Schmittgen und Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativ kann eine Standard-Kurve kann mit Hilfe einer Verdünnungsreihe von humanen Tumor-Zellen extrahiert mit der Extract-N-Amp-Kit (Zijlstra et al., 2002). Die statistische Signifikanz ausgewertet wird mittels Student T-Test oder ANOVA-Analyse von Kontroll-und Versuchsgruppen.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Der Hühnerembryo Metastasen-Modell. A) Ein Vier-Panel Diagramm, das Aussehen des Modells im Querschnitt an den wichtigen Schritten: 1. Nach 10 Tagen Inkubation. Die CAM ist eine nahezu maximale Größe erreicht. Die Arterien und Venen sind deutlich sichtbar mit der Allantois Vene gegen die Spitze des Ei positioniert. 2. Das Ei unmittelbar nach dem Bohren Sie zwei Löcher in die Schale: eine in die airsac und einer neben dem Befestigungspunkt für die Allantois Vene. 3. Das Aussehen nach einem milden Vakuum wurde verwendet, um die airsac evakuieren und Drop die CAM. Tumor-Zellen (blau) sind auf die abgelegte CAM angewendet. 4. Nachdem die veredelten Tumorzellen wachsen, werden der Tumor zusammen mit Gewebe aus dem Hühnerembryo zur Analyse geerntet B) Eine serielle Darstellung des Modells:. 1. Inkubation der Eier., 2. Kennzeichnung der Lage des Allantois-Vene., 3. Bohren von Löchern in der Eierschale., 4. Fallenlassen des CAM., 5. Schneiden einer Öffnung für Tumorzellen Pfropfen., 6. Die Anwendung der Tumorzellen., 7. Das Kühlen der Eier auf dem Eis vor dem Sammeln von Gewebe., 8. Die Ernte der Tumor nach 7 Tagen Wachstum.

Abbildung 2. Histologie der CAM Tumoren. Gewebe von tumortragenden Chorioallantoismembran genommen wurde in Formalin, geschnitten fixiert und mit einem Trichrom. A) HEp3 Tumor nach sieben Tagen Wachstum auf der CAM. B und C zeigen vergrößerte Regionen von A zeigt sowohl Tumor und Stroma. D) Normalen CAM.

Abbildung 3. Quantitative Längsschnittanalyse von Metastasen. Varianten für den Kopf-Hals-Karzinom HEp3 mit hohem oder niedrigem metastasiertem Fähigkeit (HEp3 M (High) und HEp3 M (Low)), wurden auf ihre Fähigkeit zur Verbreitung mittels Alu-PCR analysiert. Zehn Tiere wurden zu jedem Zeitpunkt für die Dauer von 7 Tagen analysiert. Diese Proben wurden gegen eine Standardkurve quantifiziert und anschließend ausgedrückt als # cells/50mg Gewebe.

Abbildung 4. Die Hemmung der spontanen Metastasierung Zellen in Tieren, die mit der Metastasierung hemmen Antikörper 1A5 behandelt. Die Tumore wurden gebildet mit 5x10 ⁵ HEp3 Zellen angewendet, um die CAM von Tag-10 Embryonen. Drei Tage nach dem Auftragen der Tumorzellen die Hälfte der Tiere mit dem anti-CD151-Antikörper 1A5 behandelt wurden. Die Lungen von tumortragenden Tieren wurden zwei Tage später geerntet und der quantitativen real-time PCR alu. Umgekehrt quantitative real-time PCR der chGAPDH wurde verwendet, um das Vorhandensein von entsprechenden Mengen von Host genomischer DNA (Die ΔΔCt Methode wurde verwendet, um die beiden Gruppen quantitativ zu vergleichen (B) bestätigen.

Abbildung 5. Auswertung Verhaftung, Wachstum und intravasation in den metastatischen Kaskade. Verhaftung, Wachstum, und die Rate der intravasation: Grundsätzlich ist Metastasen zu einer sekundären Organ durch die Beiträge der drei Aspekte definiert. Diese können quantifiziert durch eine Kombination von experimentellen Metastasen (A) und spontane Metastasen (B) sein. Mit experimentellen Metastasen (A) zu verhaften, als die Zahl der Zelle definiert wird erkannt 2h nach der Injektion. Überleben und Wachstum von Zellen verhaftet ist als die Veränderung der Zellzahl 24 Stunden nach der Injektion bestimmt. Das Wachstum ist als die Rate der Proliferation während Tage 3-7 definiert. Intravasation wird mit spontanen Metastasierung (B), wo die Zahl intravasated Zellen ist wie die metastatischen Belastung darstellen am Tag 7, dass die vorhergesagten Wert durch das Wachstum der Metastasen Belastung darstellen am Tag 6 übertrifft definiert.

Abbildung 6. Visualizing Ausbau des metastasierten in die CAM. HEp3 Zellen, die GFP wurden intravenös über Entwicklungsstörungen Tag 12 injiziert. Am Tag 1, 3 und 5 ein Ei wurde geopfert und ein Teil der CAM wurde mit einem fluoreszierenden Stereo-Mikroskop abgebildet. Die dunkelgrünen Hintergrund durch die Eierschale erstellt wird, wird das Gefäßsystem sichtbar als schwarze Linien, und die Tumorzellen sind sichtbar als hellgrüne Flecken.

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Diskussion

Das Küken CAM ist seit Jahrzehnten als Modellsystem, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie und metastatischen Progression Studie verwendet. Prinzip Auswertung des metastasierten Fähigkeiten haben in diesem Modell wurde durch eine Vielzahl von Gruppen, einschließlich der Analyse der Vegetationsruhe durchgeführt (. Aguirre Ghiso et al, 1999; Ossowski und Reich, 1983), Gewebe-Remodeling (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) und Metastasierung (Zijlstra et al, 2008;...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
1X Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995073
Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (1x), flüssig	Invitrogen	14190250	pH-Wert 7,4
Trypsin, 0,05% (1X) mit EDTA 4NA, flüssig	Invitrogen	25300054
Sportsman Hatcher	Berry Hill	1550HA	Diese Inkubatoren sind einige der am leichtesten verfügbar. Allerdings wird das Video zeigen verschiedene Geräte.
Sportsman Inkubator	Berry Hill	1502EA
Dremel Dremel	Dremel
Dremel Trennscheiben nicht. 36	Dremel	409
Tragbare Pipette Aid	Fischer	1368115E
Wattestäbchen Applikatoren	Fischer	23-400-001)
Befruchteten Eier	Verschiedene		Viele verschiedene Anbieter genutzt werden kann. Die Eier sollten etwa 35-55 Gramm betragen. Die Hühner legt, dass sie sollte zwischen 36 und 55 Wochen alt sein.
Hämozytometer	Hausser Scientific, VWR	15170-090
LWL-Mikroskopbeleuchtung	Amscope	HL250-AY	150W
25-Gauge-Nadel
Sybr Grüne Extract-N-Amp Tissue PCR Kit	Sigma-Aldrich	XNATRG