Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

Zusammenfassung

Live-Gram-negative und gram-positive Bakterien können auf Gelatine-beschichteten Glimmer immobilisiert werden und abgebildet in Flüssigkeit mit Atomic Force Microscopy (AFM).

Zusammenfassung

AFM ist ein hochauflösender (nm-Skala) Imaging-Tool, das mechanisch tastet eine Oberfläche. Es hat die Fähigkeit, Bilder von Zellen und Biomolekülen, in einer flüssigen Umgebung, ohne die Notwendigkeit, chemisch behandeln die Probe. Um dieses Ziel zu erreichen, muss die Probe ausreichend, um die Montagefläche haften, um die Entfernung von Kräften von der Scan-AFM Cantileverspitze ausgeübt zu verhindern. In vielen Fällen hängt die erfolgreiche Bildgebung bei der Immobilisierung der Probe auf der Montagefläche. Optimalerweise sollten Immobilisierung werden minimal-invasive, um die Probe, so dass Stoffwechselvorgänge und funktionalen Eigenschaften nicht beeinträchtigt werden. Durch die Beschichtung frisch gespaltenem Glimmer Oberflächen mit Schweinen (Schweine-) Gelatine, können negativ geladene Bakterien auf der Oberfläche immobilisiert werden und abgebildet in Flüssigkeit, die durch AFM. Immobilisierung von Bakterienzellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer ist sehr wahrscheinlich aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen Bakterien und den positiv geladenen Gelatine. Mehrere Faktoren können mit bakteriellen Immobilisierung, einschließlich der chemischen Bestandteile der Flüssigkeit, in der die Bakterien ausgesetzt, die Inkubationszeit der Bakterien auf die Gelatine beschichtete Glimmer, Oberflächeneigenschaften des Bakterienstammes und dem Medium, in dem die Bakterien sind abgebildet stören. Insgesamt ist die Verwendung von Gelatine-beschichtete Glimmer gefunden allgemein anwendbar zu sein für die Bildgebung mikrobieller Zellen.

Protokoll

1. Mica Zubereitung:

1. Schneiden Sie den Glimmer (Electron Microscopy Sciences) mit einer Schere auf die Größe notwendig, die AFM-Mikroskop (ca. 22 × 30 mm) passen.
2. Cleave der Glimmer auf beiden Seiten, in der Regel mit Klebeband an die äußere Schicht zu entfernen, bis nur noch glatte ungebrochene Schichten bleiben.

2. Herstellung von Gelatine-Lösung:

1. Add 100 ml destilliertem Wasser in ein Labor Flasche.
2. Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle bis das Wasser zu sieden beginnt. (Wenn eine Mikrowelle nicht zur Verfügung steht, kann das Wasser in einem Becherglas auf einer Heizplatte erhitzt werden.)
3. Abwiegen 0,5 Gramm der Gelatine (Sigma G-6144, G-2625 oder G-2500) und fügen Sie die heiße destilliertem Wasser.
4. Vorsichtig schwenken die Flasche, bis die Gelatine vollständig gelöst ist.
5. Kühlen Sie die Gelatine-Lösung auf 60-70 ° C.
6. Gießen Sie ca. 15 mL in ein kleines Becherglas (20 ml), in die der Schnitt gespaltenem Glimmer getaucht werden kann.

3. Mica-Beschichtung:

1. Tauchen Sie die Glimmer Quadrate in die erwärmte Gelatinelösung und ziehen schnell, so dass die Glimmer beschichtet ist (Abb. 1a).
2. Nach der Beschichtung, die Unterstützung der Glimmer sofort, am Waldrand, auf einem Papiertuch, um in der Luft trocknen lassen (Abb. 1b). Die Gelatine beschichtete Glimmer kann für mindestens 2 Wochen verwendet werden. Die überschüssige Gelatine-Lösung kann im Kühlschrank aufbewahrt werden und für rund einen Monat durch einfaches Erhitzen der Stammlösung zwischen 60-70 ° C. Es muss darauf geachtet, dass die Gelatine nicht beim Erwärmen abgekocht werden.

4. Montage Bakterien auf Gelatine beschichtete Glimmer:

1. Pellet 1 ml einer Bakterienkultur (0,5 bis 1,0 OD bei 600 nm) bei 800 bis 4.500 rcf. Je nach Bakterien, die mindestens rcf, dass die Pellets der Zellen in ca. 5 Minuten.
2. Waschen des Pellets in das gleiche Volumen der gefilterten deionisiertem Wasser oder Puffer.
3. Sammeln Sie die Zellen wieder abzentrifugiert.
4. Das Pellet sofort in 500 ul der Nanopure deionisiertem Wasser oder Puffer. (Die Bakteriensuspension sollte sichtbar trüb werden, um eine ausreichende Konzentration von Zellen für die AFM haben.)
5. Übernehmen Sie die Zellsuspension (10-20 mL), um die Gelatine-beschichtete Glimmer und verteilt auf der Oberfläche mit einer Pipettenspitze (Abb. 1c). Es sollte darauf geachtet werden, nicht körperlich berührt die Gelatine Oberfläche mit der Pipettenspitze während der Anwendung oder Verbreitung der bakteriellen Lösung sein.
6. Die Oberfläche für 10 Minuten ruhen lassen und gründlich mit einem Strom von Wasser oder Puffer (Abb. 1 cd). Während des gesamten Verfahrens darauf achten, dass die Probe nicht erlaubt ist, um zu trocknen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 2 zeigt beispielsweise Bilder von Bakterienzellen, die auf Gelatine beschichtete Glimmer wurden montiert und bebildert von AFM. In unseren Labors werden die Proben in der Regel abgebildet mit einem PicoPlus Rasterkraftmikroskop (Agilent Technologies, Tempel, AZ) mit einer 100 um Abtastkopf ausgestattet. Das Gerät ist bei 128-512 Pixel pro Zeile Scan bei einer Scan-Geschwindigkeit von 0,5-1,0 Linien / s betrieben Die Ausleger, die typischerweise verwendet werden, sind Veeco Siliziumnitrid-Sonden (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) mit nominal Federkonstanten zwischen 0,01 bis 0,1 nN / nm.

Abbildung 1. Gelatine bei einer Temperatur von 60-70 ° C in einer 20 ml Becherglas gegeben. Mit einer Pinzette frisch gespaltenem Glimmer Plätze sind völlig in die Gelatine (a) zurückgezogen und aufrecht auf einem Papiertuch gelehnt einer Mikrozentrifuge Rack (b) platziert eingetaucht. Ein Tropfen einer bakteriellen Probe wird auf dem Glimmer und verbreiten mit einer Pipettenspitze in der X-und Y-Richtung (c) platziert. Nachdem man die Probe auf die Glimmer-Oberfläche für mindestens 10 Minuten inkubieren, spülen Sie die Probe in einem Strom von destilliertem Wasser. Wenn die Immobilisierung arbeitete Sie in der Lage, um ein milchiger Fleck auf dem Glimmer zu sehen, wie auf der rechten Seite von (d) gezeigt. Wenn die Immobilisierung nicht funktioniert hat man ein klares Stück Glimmer als in der linken Seite zu bekommen. Die milchiger Fleck auf der Glimmerschuppen, um die Konzentration der Bakterien in den Tropfen, die Sie auf der Gelatine behandelten Glimmer.

Abbildung 2. AFM-Aufnahmen von E. coli. In Panel (a) werden die Zellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer montiert und abgebildet in 0,005 M PBS. Zum Vergleich wird ein Bild von Bakterienzellen auf Gelatine-beschichteten Glimmer montiert und abgebildet in der Luft in Panel (b) gezeigt. Obwohl Septen sind deutlich sichtbar in Bild flüssig, höhere Auflösung, als durch die Anwesenheit von Pili (kleines Panel (b)) angegeben, sammelte sich in Luft gewonnen werden.

Diskussion

Verschiedene Faktoren können die mikrobielle Zelle Montage-und Imaging von AFM. Die Gelatine, die zur Beschichtung eingesetzt wird der Glimmer ist wichtig. Gewerbliche Gelatine wird aus einer Reihe von Wirbeltieren einschließlich Fischen, Kühen und Schweinen isoliert. Sowohl die Herkunft und das Verarbeitungsverfahren bestimmen die Gelatine die Eignung für die bakterielle Immobilisierung. Zahlreiche Quellen und Arten von Gelatine wurden auf ihre Wirksamkeit in Immobilisierung Bakterien untersucht [1]. Die beiden eff...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalog-Nummer
Gelatine	Sigma, St. Louis, MO	G6144, G2625 oder G2500
PicoPlus Atomic Force Microscope	Agilent Technologies, Tempe, AZ
AFM Cantilever	Veeco, Santa Barbara, CA	MLCT-AUHW