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Method Article
Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.
Mücken übertragen eine Reihe von unterschiedlichen Viren, einschließlich wichtiger menschlicher Krankheitserreger wie West-Nil-Virus, Dengue-Virus, und chickungunya Virus. Viele dieser Viren haben in ihrer endemischen Bereichen intensiviert und ausgebaut, um neue Gebiete, erfordern eine effiziente Überwachung und Steuerung Programme, um diese Bedrohungen zu reagieren. Eine Strategie zur Virus-Aktivität zu überwachen ist das Sammeln von einer großen Anzahl von Moskitos aus endemischen Standorte und testen sie für die virale Infektion. In diesem Artikel beschreiben wir, wie in der Handhabung, Verarbeitung und Display Mücken auf infektiöses Virus von Vero-Zellkultur-Assay-Feld-gesammelt. Mücken werden durch trap Lage und Arten sortiert, gruppiert und in Pools mit ≤ 50 Personen. Pooled Proben werden in Kochsalzlösung mit einem Mixer-Mühle und die wässrige Phase auf konfluente Vero-Zellkulturen (Clone E6) inokuliert homogenisiert. Die Zellkulturen werden für zytopathischen Wirkung vom Tage 3-7 post-Impfung und keine Viren in der Zellkultur gezüchtet durch die entsprechenden diagnostischen Tests identifiziert werden überwacht. Durch die Verwendung dieses Ansatzes haben wir 9 verschiedene Viren aus Moskitos in Connecticut, USA gesammelt isoliert, und unter diesen, 5 ist bekannt, dass Menschen eine Krankheit verursachen. Drei von diesen Viren (West-Nil-Virus, Potosi Virus und La Crosse-Virus) stellen neue Rekorde für Nordamerika oder der New England Region seit 1999. Die Fähigkeit, eine breite Vielfalt von Viren zu erkennen ist entscheidend für die Überwachung sowohl etablierte als auch neu auftretende Viren in der Mücke Bevölkerung.
1. Mosquito Sortierung und Identifikation
2. Biosafety Überlegungen Virus von Stechmücken zu isolieren
3. Vorbereitung von Vero-Zellen
4. Vorbereitung der Moskito-Pools
5. Inokulation von Vero-Zellen mit Moskito-Pool Homogenaten
6. Screening Vero-Zellen für Viruswachstum
7. Vorbereitung der Reagenzien
8. Repräsentative Ergebnisse
Neun verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien wurden von Mücken im laufenden landesweiten Überwachung in Connecticut 1997-2010 (Tabelle 1) gesammelt und verwertet. Fünf dieser Viren sind bekannt für die menschliche Krankheit, die wichtigsten Krankheitserreger West-Nil-Virus und östlichen Pferde-Enzephalitis-Virus verursacht. Neue Entdeckungen sind: die erste Isolierung von WNV aus Stechmücken gesammelt inNordamerika in 1999 2, die erste Trennung von Potosi Virus in Nordosten der USA im Jahr 2000 3, und die erste Trennung von La Crosse Virus in New England im Jahr 2005 4.
Virus | Familie | No-Isolate | Nr. Standorten | Nein Jahren gemessen | Krankheit beim Menschen | Refs. |
West-Nil-Virus | Flaviviridae | 1.002 | 94 | 12 | Mittelschwere bis schwere, Fieber, Enzephalitis | 2,5 |
Eastern equine-Enzephalitis-Virus | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Schwere, Enzephalitis | 6,7 |
Highlands J-Virus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Nicht bekannt | 6 |
Jamestown Canyon-Virus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Leichte bis moderate, Fieber, Meningitis | 8 |
Potosi Virus | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Nicht bekannt | 3 |
Cache Valley-Virus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Leichte bis schwere, Fieber, neurologische Erkrankung in zwei dokumentierte Fälle | |
Trivittatus Virus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Nicht bekannt | |
La Crosse Virus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Mittelschwere bis schwere, Enzephalitis | 4 |
Flandern-Virus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Nicht bekannt |
Tabelle 1. Viren in Feld-gesammelt Mücken durch Vero-Zellkultur-Test nachgewiesen. Moskitos waren während der landesweiten Überwachung in Connecticut from 1997-2010 gesammelt.
Vero-Zellkultur-Assay dient als eine effektive Methode zur Dynprofeld-Mücken gesammelt für eine Vielzahl von Viren. Dies steht im Gegensatz zu molekularen Methoden, die gezielt eine oder einige wenige Viren von Interesse. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Vero-Zellkultur-Assay gleich ist, wenn nicht empfindlicher als RT-PCR 7 und versorgt uns mit Virusisolate, dass in unserer Referenz-Sammlung für zukünftige Studien gespeichert werden. Dennoch kann Zellkultur-Systeme nicht angemessen in vielen ...
Wir danken für die wichtigen Beiträge der Drs. John Anderson, Andrew Main und Shirley Tirrell zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) und dem US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 und CONH00773) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenz / Ausrüstung | Firma | Catalog Number | |
---|---|---|---|
Rinderfötenserum | Gibco - Invitrogen | 16140 | |
Anti-biotic/mycotic | Gibco - Invitrogen | 15240 | |
Natriumbicarbonat NaHCO 3, 7,5% Soln. | Gibco - Invitrogen | 25080 | |
L-Glutamin 200 mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 | |
Pulverförmige minimal essential medium (MEM) | Gibco - Invitrogen | 11700 | |
10X Dulbecco PBS | Gibco - Invitrogen | 14080 | |
Trypsin-EDTA | Gibco - Invitrogen | 15400 | |
Kaninchenserum | Gibco - Invitrogen | 16120 | |
Vero-Zellen (Klon E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Kleine Zellkulturflaschen, belüftete Kappen, 25 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353112 | |
Große Zellkulturflaschen, belüftete Kappen, 175 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353108 | |
Verkupferter BB, 4,5 mm | Crosman | 0767 | |
Schwingmühle | Retsch | MM300 | |
Isopack Gefriergestelle | Eppendorf | 022510240 |
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