Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix, bestehend aus Kollagen Typ I und primären humanen Fibroblasten beschrieben. Diese organotypischen Gel dient als nützliches Substrat invasive Zellmigration beurteilen, da es grundlegende Funktionen von Gewebestroma nachahmt und ist offen für viele Formen der Mikroskopie.

Zusammenfassung

Zellmigration ist grundlegend für viele Aspekte der Biologie, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, die zellulären Reaktionen des Immunsystems und Metastasierung von Tumorzellen. Migration hat auf Deckgläsern wurden untersucht, um zelluläre Dynamik zugänglich Untersuchung mit dem Lichtmikroskop zu machen. Allerdings hat sich gezeigt, dass viele Aspekte der Zellmigration auf Merkmale der lokalen Umgebung einschließlich seiner Elastizität Proteinzusammensetzung und Porengröße, die nicht originalgetreu durch starre zweidimensionalen Substraten wie Glas und Kunststoff ¹ dargestellt abhängen. Darüber hinaus hat die Interaktion mit anderen Zelltypen, einschließlich Stromafibroblasten ² und Immunzellen ^3, wurde gezeigt, dass eine kritische Rolle bei der Förderung der Invasion von Krebszellen spielen. Untersuchung auf molekularer Ebene zunehmend gezeigt, daß molekularer Dynamik, einschließlich Reaktion auf Medikamente, identischer Zellen signifikant verschieden sind, wenn verglichen In vitro und in vivo ^4.

Im Idealfall wäre es am besten, um die Zellwanderung in seiner natürlich vorkommenden Kontext, in lebenden Organismen zu studieren, dies ist jedoch nicht immer möglich. Zwischenprodukt Gewebekultursystemen wie Zellen abgeleiteten Matrix, Matrigel, organotypische Kultur (hier beschrieben) Gewebeexplantate, Organoiden und Xenotransplantate sind daher wichtig experimentellen Zwischenprodukte. Diese Systeme ungefähre bestimmte Aspekte der in vivo-Umgebung sind aber offen für experimentelle Manipulation wie die Verwendung von stabil transfizierten Zelllinien, medikamentöse Behandlung Regime, langfristige und hochauflösende Bildgebung. Solche Zwischensysteme sind insbesondere als Prüfgeländen um Sonden herzustellen validieren und Parameter, die zur Abbildung des dynamischen Verhaltens von Zellen und fluoreszierenden Reporter vor der Durchführung Bildgebung in vivo ^5. Als solche können sie eine wichtige Rolle bei der Verringerung des Bedarfs an Experimente dienen living Tieren.

Protokoll

Ein. Gründung der Fibroblasten-Kulturen aus Hautexplantaten

1. 4 mm Stanzbiopsien vom menschlichen Unterarm erworben werden in MEM platziert ergänzt 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 pg / ml Fungizone.
2. Schneiden Sie subkutanes Fett und fein hacken die Biopsie in kleine Stücke durch Schaukeln eine Reihe 24 Skalpell gegen den Boden der Petrischale.
3. Die Gewebeschnitte Aufschlämmung in einem 25 cm ² Gewebekulturbehälter mit primären Fibroblasten Wachstumsmedium (MEM mit 10% FCS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 25 ug / ml Fungizon ergänzt) zugesetzt, bis die Oberfläche des Fadens bedeckt, aber flüssige Tiefe unzureichend für Gewebe zu schweben.
4. Nach 3-tägiger Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2, 3 ml von primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien.
5. Nach einer weiteren 3 Tagen Inkubation Change-Medien mit frischen primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien, oder wenn cells sind nahezu konfluenten sie 1.04 kann in frischen Medien aufgeteilt werden. (Fungizone können ab diesem Zeitpunkt entfallen).

2. Stufe I - Herstellung von Kollagen I aus Rattenschwänzen

Hinweis: Protokoll für ca. 12-14 Jugendlichen (frisch oder gefroren) Rattenschwänzen

1. Planen Rattenschwanz durch Waschen in 70% igem Ethanol und entfernen Sehnen wie folgt:
2. Entfernen Sie die Haut vor Rattenschwanz durch Schneiden in der Mitte des Schwanzes von oben nach unten mit einem Skalpell und Läuten entlang der Länge des Schwanzes.
3. Trennen Sehne vom Kern des proximalen Bereich des Schwanzes.
4. Entfernen Sehne zu dem distalen Bereich des Schwanzes Vermeidung der Hülle mit gezahnten Pinzette.
5. Extrakt 1 g Sehne / 250 ml 0,5 M Essigsäure durch Rühren bei 4 ° C für 48 h durchgeführt.
6. Zentrifugieren Extrakt (7.500 xg) für 30 Minuten und entsorgen Sie die Pellets.
7. Hinzufügen eines gleichen Volumens von 10% (w / v) NaCl zu dem Überstand, und rühren für 30-60 min.
8. Säule (10.000 × g) für 30 Minuten, den Überstand verwerfen und wieder aufzulösen der Niederschlag in 0,25 M Essigsäure bei ~ 1:1-Verhältnis von Rühren für 24 h bei 4 ° C.
9. Dialysieren das Kollagen Lösung gegen 6-8 Änderungen 6L ~ 17,5 mM Essigsäure (1 ml Essigsäure je Liter kaltes Wasser, Wechsel 2 x täglich).
10. Zentrifuge dialysiert Kollagen bei 30.000 xg für 1,5 Stunden.
11. Überstand entfernen und in sterile Flasche.
12. Einstellen der Kollagen I-Konzentration auf ~ 2 mg / ml unter Verwendung von 0,5 mM Essigsäure bei 4 ° C.

3. Stage II - Einrichten der 3D-Matrix mit eingebetteten Fibroblasten (lassen für 8 Tage kontrahieren).

1. Montieren Sie die Mischung mit kalter Reagenzien bei 4 ° C in einer vorgekühlten Flasche. Halten Kollagen I auf Eis.
2. Für ein T75-Flasche von konfluenten Fibroblasten (~ Zellzahl 1 x 10 ⁶⁾ Verwendung:
   • 25 ml Rattenschwanz Kollagen (ca. conc 2mg/ml)
   • 3 ml 10xMEM
   • 0,22 M NaOH: erste, fügen 2ml, dann tropfenweise unter Rühren, bis das Kollagen wird orange,
   • aber nicht rosa (in der Regel bis zu 3 ml). Ungefähre p ^H = 7,2.
   • Anmerkung: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Mittel / Gel-neutral oder schwach sauer bleibt als Fibroblasten nicht zusammenziehen wird, wenn das Gel noch leicht alkalischen Bedingungen ausgesetzt.
3. Trypsinise die Fibroblasten, drehen bei 400 xg für 5 Minuten und entfernen Überstand.
4. Während 5 Minuten vor spinnen: Bereiten 12 x 35 mm Kunststoff-Geschirr - normalerweise erreicht 12 Gerichte aus einem Kolben von Fibroblasten / Kollagen-Mix.
5. Resuspendieren Fibroblasten in 3 ml FCS und sofort an das Kollagen Mischung hinzufügen und umrühren.
6. Platte etwa 2,5 ml Kollagen / Fibroblasten pro Schale so schnell wie möglich. Versuchen Sie, Blasen und Kollagen Einstellung zu vermeiden.
7. Lassen Sie das Kollagen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ in Luft für 10 Minuten eingestellt.
8. 1ml von Fibroblasten wachsenth (DMEM + 10% FCS).
9. Trennen der Kollagen / Fibroblasten-Matrix von den Seiten der Schale mit Hilfe einer Pipette.
10. Nächster Tag: In 1 ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (DMEM + 10% FCS).
11. Ändern Medien jeden zweiten Tag. Lassen Kollagen / Fibroblasten Matrix Vertrag für ca. 8 Tage, bis sie in einer 24-Well-Platte passen (Kontraktion von ~ 3,5 cm bis 1,5 cm im Durchmesser, siehe Abbildung 1).

Hinweis: Die Kollagen-Konzentration sollte so eingestellt werden, um die Anwendung angepasst werden. Je verdünnter die Kollagenlösung, desto schneller wird es durch die Fibroblasten kontrahiert werden. Geringfügige Unterschiede in Kontraktionsrate wird mit verschiedenen Chargen von Kollagen in der gleichen Konzentration erfahren werden. Ebenso verschiedenen Fibroblasten-Kulturen wird die Kollagen-Gele mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten kontrahieren, und je mehr Fibroblasten präsentieren, desto schneller die Geschwindigkeit der Kontraktion. Kollagenkonzentration und Fibroblasten-Dichte kann daher durch angepasst, um die Rate der Kontraktion zu verändern,und die endgültige Dichte des Kollagengels.

4. Stage II - Plating Zellen von Interesse auf der Oberseite der Matrix

Hinweis: Sterilisieren alle Zangen und Geräte mit Ethanol vor dem Gebrauch.

1. Mit stumpfen Pinzette vorsichtig bewegen vertraglich Matrix 24-Well-Schale. Stellen Sie sicher, dass es nicht klappt.
2. Bereiten Suspension von Zellen von Interesse bei etwa 4 x 10 ⁴ / ml und Platte 1ml (nach trypsinising, Spin-Zellen loszuwerden Trypsin) auf der Oberseite der Matrix. Tatsächliche Anzahl der Zellen benötigt variiert je nach Zelltyp. Zellmedium sollte normalen Wachstumsmedium für die Zellen von Interesse sein.
3. Erlauben Zellen bis zur Konfluenz auf der Matrix, etwa 3-5 Tage wachsen gelassen.

5. Stufe III - Übertragung der Matrix auf einem Raster für die Invasion (ca. 0-21 Tage)

1. Cut Edelstahlgitterroste ein Stativ zu schaffen und autoklavieren vor der Anwendung (siehe Abbildung 2).
2. Zeigen sterile Gitter6 cm Schale, fügen Wachstumsmedium bis zu einem Niveau oberhalb des Gitters (ca. 10.5ml). Matrix Platz auf dem Gitter und sanft absaugen Medien so dass die Unterseite der Matrix in Kontakt mit den Medien, aber nicht getaucht. Dies wird als die Luft / Flüssigkeits-Schnittstelle, die einen Gradienten, Invasion fördert schafft bezeichnet. Ersetzen Medium alle zwei Tage (siehe Abbildung 2).
3. Live-Zelle kann kontextuellen Bildgebung mit fluoreszierenden Zellen zu diesem Zeitpunkt oder früher abgebildet werden. Die kontrahierten oder fibrillären Kollagen kann ich abgebildet mit Second Harmonic Generation (SHG, siehe Abbildung 3). Mittels Multi-Photonen-Anregung mit großem Feld Detektion kombinierten wir feststellen, dass SHG mindestens 100 um in die Matrix abgebildet werden, wohingegen Zellen, die GFP cytoplasmatischen abbildbar mindestens 200 um tief sein.

Hinweis: Im Hinblick auf die Quantifizierung der Invasion, definiert der Tag, an dem Matrizen auf den Gittern platziert werden Tag 0. Platzierung auf Gittern einen Gradienten von Zellkulturmedien, die Invasion int fördert o die Matrix. Die Proben können in den nächsten 1 abgebildet werden - 21 Tage (oder länger) an biologischen Prozessen wie Invasion, Proliferation, Überleben oder Differenzierung (siehe Referenzliste) zu beurteilen.

6. Stufe IV - Fixation

1. 5 ml 4% PFA in einem Falcon-Röhrchen.
2. Übertragen Sie die Matrix auf eine ebene Fläche. Schneiden Sie die Matrix in zwei Hälften mit einem frischen, sauberen Skalpell (wie werden Sie Färbung der Querschnitt), heben Sie die Matrix mit Skalpell und Transfer zum 4% PFA, fix über Nacht.
3. Organotypische Matrizen sind nun bereit, mit dem Antikörper färben / Fleck der Wahl (siehe Abbildung 3).

7. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 Beispiel Fibroblasten vergeben Kollagen I. Mischung aus Fibroblasten und Rattenschwanz Kollagen aus der Petrischale gelöst und erlaubt, über 6-8 Tage schrumpfen.

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Abbildung 2 Organotypische Assay Progression. Eine schematische organotypischer Einrichtung und Progression. B, Beispiel von Kollagen / Fibroblasten-Matrix auf der Oberseite Edelstahl, sterilen Gitters, um Luft / Flüssigkeits-Grenzfläche zu schaffen.

Abbildung 3 Anwendungen organotypischer Assay. A, B eindringenden nichtinvasiven und invasiven duktalen Adenokarzinom (PDAC) Zellen im Laufe der Zeit mit organotypischen Matrix. C, lebenden Hautäquivalent, das eine geschichtete Epidermis eines Fibroblasten vergebene kollagenen dermalen Komponente. D, eindringenden C8161 Melanomzellen in einem Fibroblast -Vertrag kollagenen dermal gleichwertig. E, invasive PDAC Zellen (grün) interagieren und Invasion mit Fibroblasten (rot) in der organotypischen Matrix. F , visualisiert invasive PDAC Zellen (grün), die mit einer entwürdigenden Umgebung extrazellulären Matrix (violett) mit Multiphotonen-basierte Erzeugung der zweiten Harmonischen.

Diskussion

Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix geeignet für Untersuchungen von invasiven Zellmigration ^6-8. Die Matrix besteht aus Kollagen Typ 1 Fibrillen, die sich über einen Zeitraum von mehreren Tagen durch primäre menschliche Fibroblasten epidermalen zusammengezogen sind. Das Kollagen durch Säureextraktion nicht enzymatische Verdauung, die Reaktivität bewahrt an den Poly-Peptid Enden und fördert Vernetzung der Kollagenfibrillen zu größeren Aggregaten bei Neutralisation der Pufferbedingungen ⁹ hergestellt. Dies führt zu einem rekonstituierten Gel, stärker imitiert die Funktionen von Kollagen in vivo und hat wichtige Konsequenzen für die invasive Eigenschaften von Zellen in den Gelen gezüchtet. Es spielt keine Rolle, ob frisch oder gefroren Ausgangsmaterial verwendet wird, aber die Verwendung von Jugendlichen Rattenschwänzen ist wichtig, weil Kollagen Vernetzung ist labile bei jüngeren Tieren. Collagen I von jüngeren Tieren ist daher leichter zu extrahieren und re-stellt with höhere Treue.

Die Kollagenmatrix fixiert und mit Antikörpern gegen entweder invasiv Tumorzellen oder Stromafibroblasten ^2,10 gerichteten gefärbt werden und sind sehr nützlich zum Testen der Wirksamkeit von Wirkstoffen, die Invasion ^5,6 hemmen könnte.

Obwohl dieses Protokoll schlägt die Verwendung von primären humanen Hautfibroblasten, ist es machbar, primäre Fibroblasten, die von anderen Gewebearten zu verwenden, je nach der Art der zu untersuchenden Gewebe. Es ist auch möglich, die Kulturen mit immortalisierten Fibroblasten, einschließlich Zellen, die stabil mit fluoreszierenden Proteins transfiziert Konjugate herzustellen. Auf diese Weise sowohl Stroma-und Tumorzellen markiert, um Zell-Zell-Interaktionen während der Invasion ¹¹ visualisieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
10x MEM	Gibco	21430	-
NaOH	Sigma	367.176-500G	Bereiten 0,22 M Vorratslösung in Wasser
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
35 mm Schalen	Falke	353001	Für den Schritt 3,4
60 mm Schalen	Falke	353004	Für den Schritt 5,2
Frühling Pinzette stumpf	Samco	E003/02	Zahnriemen, nicht glatt
16% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	15710	Verdünnte bis 4% in PBS vor der Verwendung
Bildschirme für cd-1, Größe 40 mesh	Sigma	S07707-5EA	Edelstahlgitterroste, 5 pro Packung
Dialyseschlauch	Medicell International	7607 2295	12 bis 14 kD
PBS	Oxoid	BR0014G	-
Essigsäure	Sigma	242853	-
24 Well-Platte	Falke	353047	Für den Schritt 4,1
Fungizone	In Vitrogen	15290018	-