Die Verschont Nerve Injury (SNI) Modell induzierte mechanische Allodynie in Mäusen

Zusammenfassung

Die Verschont Nerve Injury Tiermodell wird hier als ein Maus-Modell von peripheren neuropathischen Schmerzen nach einer partiellen Denervation der Ischiasnerv durch Läsion der Tibia-und N. peronaeus Filialen beschrieben, so dass die verbleibenden Nervus suralis intakt. Verhaltensmodifikation durch mechanische Allodynie wird durch von Frey Filamente quantifiziert.

Zusammenfassung

Periphere neuropathische Schmerzen ist eine schwere chronische Schmerzen Bedingung, die von einem Trauma zu sensiblen Nerven in den peripheren Nervensystems führen kann. Das erspart Nervenverletzung (SNI) Modell induziert Symptome der neuropathischen Schmerzen wie mechanische Allodynie, dh Schmerzen durch taktile Reize, die normalerweise nicht provozieren eine schmerzhafte Reaktion [1].

Die SNI Mausmodell handelt Ligation von zwei der drei Zweige der Ischiasnerv (Nervus tibialis und der N. peronaeus), während der N. suralis ist intakt [2]. Die Läsion Ergebnisse in deutlichem Überempfindlichkeit im seitlichen Bereich der Pfote, die durch die verschont suralis innerviert ist. Die nicht operierten Seite der Maus können als Kontrolle verwendet werden. Die Vorteile des SNI-Modell sind die Robustheit der Reaktion, und dass es nicht erforderlich Experte mikrochirurgische Fähigkeiten.

Die Schwelle für mechanische Schmerzreaktion wird durch Tests mit von Frey Filamente der zunehmenden Biegekraft, die wiederholt gegen die seitlichen Bereich der Pfote gedrückt werden bestimmt [3], [4]. Eine positive Schmerzreaktion als plötzlich Pfote Rückzug definiert, der Wimper zu zucken und / oder Pfote leckt induziert durch das Filament. Eine positive Reaktion in drei von fünf repetitive Reize als Schmerzgrenze definiert.

Wie im Video-Protokoll zeigte, Erfahrung C57BL / 6 Mäusen tiefe Allodynie so früh wie am ersten Tag nach der Operation und Pflege dieser für mehrere Wochen.

Protokoll

1. von Frey Baseline-Messungen vor der Operation

Für von Frey Testverfahren finden Sie in Abschnitt 5.

2. Anästhesie / der Zubereitung

1. Anesthetize der Tiere (intraperitoneale Injektion einer Mischung von 100mg/kg Ketamin und 15 mg / kg Xylazin).
2. Legen Sie das Tier an einem ruhigen Ort, bis sie vollständig narkotisiert (zB mit einem Papiertuch abgedeckt).
3. Überprüfen Reflexe durch Kneifen der Spitze des Schwanzes und der Pfoten mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, dass die Tiere nicht mehr reagiert, bevor Sie fortfahren werden.
4. Subkutan zu injizieren (zurück Schulterbereich) 0,5 ml isotonischer Kochsalzlösung mit Antibiotika, zB Ampicillin (um Dehydration zu vermeiden und eine Infektion zu verhindern, obwohl dies einem kleinen operativen Eingriff).
5. Mit einem elektrischen Rasierer rasieren das Operationsfeld von leicht unterhalb des Knies Bereich der Hüft-Bereich (für Rechtshänder die linke Hinterbein wird empfohlen).
6. Bewerben Augensalbe in die Augen mit einem Wattestäbchen.
7. Legen Sie das Tier auf seiner rechten Seite und legen Sie den linken Hinterlauf auf einer kleinen Plattform zu halten, erhöht. Sichern Sie das Bein mit Klebeband.
8. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit wechselnden scrubs von Ethanol und betadine von OP-Gebiet aus.

3. Chirurgie

1. Suchen Sie die Knie mit dem Daumen der linken Hand und mit einem Skalpell eine App zu machen. 1 cm Schnitt in Längsrichtung proximal des Knies.
2. Öffnen Sie die Haut durch stumpfe Präparation mit der Spitze ein Paar sterile Schere.
3. Trennen Sie die Muskelschicht durch stumpfe Präparation direkt neben dem deutlich sichtbaren Blutgefäße, die Oberschenkelknochen (Femur) schließen. Wenn es richtig gemacht, wird die Muskelschichten leicht ohne Blutung getrennt und enthüllt die Ischiasnerv rechts unterhalb der Muskeln.
   Kommt es zu Blutungen zB durch Beschädigung eines Blutgefäßes in der Nähe des Knies, verwenden Sie sterile Watte Knospen oder Stücke Blick auf das Blut aufzufangen. Drücken, bis die Blutung aufhört.
4. Platzieren Sie die Maus unter einem Stereomikroskop und vorsichtig die Muskeln mit einem Paar sterile Pinzette (nr. 2), um den Ischiasnerv zu visualisieren. Retraktoren kann auch angewendet werden.
5. Identifizieren Sie die Fläche, wo der N. suralis Zweige von den Ischiasnerv. Der N. suralis ist die kleinste der drei Zweige, Verzweigung nach rechts in das linke Bein.
6. Bewerben Naht (6-0 Faden) um die beiden anderen Zweige, die noch ausgeführt werden parallel (die Tibia und gemeinsame peroneus), wobei sehr vorsichtig, nicht auf die suralis Zweig berühren. Dies ist ein kritischer Schritt, da der Nervus suralis ist nach links vollkommen intakt sein.
7. Machen Sie einen engen chirurgischen Knoten. Wenn der erste Knoten ist eng, wird Kontraktionen des Körpers beobachtet werden.
8. Besorgen Sie sich die Nerven unterhalb der Naht mit einer Pinzette (nr. 5) geschnitten werden und schneiden Sie die Nerven ober-und unterhalb einer Pinzette mit einer kleinen Schere. Mit ersten Schnitt oberhalb der Pinzette, zieht der Nerven vermieden wird.
9. Cut off Fadenenden mit einem Paar von Mikro-Schere und sanft in der Nähe der Muskelschicht. Geben Sie einen Tropfen von Lidocain auf die Wunde und Naht mit chirurgischen Knoten.

4. Nach der Operation

1. Prüfen Sie, ob Augensalbe noch ausreicht.
2. Platzieren Sie die Maus in einem sauberen Käfig unter einem Papiertuch in einer bequemen Haltung. Wenn der Raum kalt ist, legen Sie ein Heizkissen unter einem Teil des Käfigs (nur unter Teil des Käfigs als das Tier sollte in der Lage zu einem kälteren Bereich, wenn sie bevorzugt zu entkommen).
3. Stellen Sie sicher, leicht zugänglich Wasser und Futter.

5. von Frey-Tests (baseline, und ab dem Tag nach der Operation)

1. Legen Sie die Maus in roten Kunststoff-Zylinder auf einem Drahtnetz Tabelle 2 Tage und 1 Tag vor der Operation gestellt. Gewöhnen für 15 min in Zylinder vor dem Test. Die rote Farbe der Zylinder hilft den Mäusen zu schnell entspannen, da sie nicht sehen können, sich gegenseitig und sind in einem dunkleren Bereich.
2. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse ruhig sind und gelten von Frey Filamente an den seitlichen Teil der Pfote: Beginnend mit dem 0,02 g Filament, erste Kraft auf der linken Pfote fünfmal über einen Zeitraum von insgesamt 30 Sekunden (ca. 2 Sekunden pro Reiz) und gauge der Maus die Reaktion nach jeder Anwendung. Wiederholen Sie mit dem gleichen Faden und die linke Pfote eines anderen Mäuse, und dann wieder von vorne anfangen mit der rechten Pfote der ersten Maus, bevor sie zu den nächsten Faden, z. B.:
   
   • Maus 1: linke Pfote 5 mal mit Filament 0,02 g
   • Maus 2: linke Pfote 5 mal mit Filament 0,02 g etc.
   • Maus 1: rechte Pfote 5 mal mit Filament 0,02 g
   • Maus 2: rechte Pfote 5 mal mit Filament 0,02 g etc.
   • Maus 1: linke Pfote 5 mal mit Filament 0,04 g
   • Maus 2: linke Pfote 5 mal mit Filament 0,04 g etc.
3. Response in drei von fünf Reize wird als positive Reaktion angesehen. Filaments oben threshold angewendet, um den Schwellenwert zu überprüfen.
   Response = plötzliche Pfote Rückzug, plötzlicher Wimper zu zucken, plötzliche Pfote leckt.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Von Frey Tests auf C57BL / 6 Mäusen Alter 8-10 Wochen alt wurde durchgeführt, 1 Tag vor der Operation und immer wieder nach der Operation. 4-8 Tiere wurden in jeder Gruppe enthalten. Von Frey Tests auf der operierten Seite ist durch ipsilateral vertreten und die nicht operierte Kontrolle Seite ist durch kontralaterale vertreten. Der Tag nach der Operation die Tiere entwickeln signifikanter Überempfindlichkeit auf der operierten Pfote, während die nicht betrieben wird nur geringfügig beeinträchtigt gegenüber scheinoperierten Mäusen. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, ipsilateral gegenüber kontralateral).

Diskussion

Kritische Schritte

Schäden an der Nervus suralis sollte vermieden werden, um pathologische Veränderungen in den intakten N. suralis nach Verletzungen der Tibia und gemeinsame peroneus zu studieren. Kollateralschäden an der N. suralis kann zu Lähmungen führen und damit sichtbar gemacht werden wie das Ziehen des operierten Hinterbein.

Nur der lateralen Seite der Pfote wird durch die verschont suralis innerviert und damit entwickelt sich nur dieser Bereich Neuropathie. Testen anderen Bereichen, durch die durchtrennten Nerven innerviert, kann stark spannen die Auswertung der veränderten mechanischen Schwelle.

Mögliche Änderungen

Andere Arten von Ligationen können Zusatzprogramme werden in Bezug auf das Studium pathologischer Schmerzzustände folgenden peripheren Nervenverletzung, wie chronische Verengung Verletzungen [5] oder teilweise Nerven Ligation [6]. Jede experimentelle Vorgehen führt zu deutlichen phänotypische Veränderungen, die vor dem postoperativen Tests in Betracht gezogen werden sollte.

Darüber hinaus können auch andere sensorische Tests wie thermische Hyperalgesie [7] angewendet werden, obwohl dieser Phänotyp ist weniger robust folgenden SNI.

Zukünftige Anwendungen

Diese Technik kann für die Prüfung von Medikamenten verändern die Entwicklung oder Wartung von mechanischer Allodynie eingesetzt werden [8]. Die Analyse der Ischiasnerv, damit die Spinalganglien (DRG) und / oder der Lendenwirbelsäule Rückenmark Erforschung der molekularen Mechanismen, die für die induzierte Phänotyp.

Tierversuche wurde nach guter Laborpraxis in voller Übereinstimmung mit dem dänischen und europäischen Vorschriften durchgeführt. Alle Experimente wurden von der dänischen Tierversuche Inspectorate unter dem Ministry of Justice (Erlaubnis Nummer 2006/561-1206) zugelassen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anästhesie: Ketamin und Xylazin	Skalpell
Augensalbe	Pinzette nr. 2
Trockenrasierer	Pinzette nr. 5
Handschuhe	Schere für stumpfe
70% (v / v) Ethanol	Micro Schere
Cotton-Wool-Knospen / Blick	6,0 Prolene nicht-resorbierbares Nahtmaterial
Stereo-Mikroskop	2 x Nadelhalter
Klebeband	Heizkissen
von Frey Filamente (0,02 bis 2,0 g für Mäuse) (Stölting)