Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Zusammenfassung

Der gesamte Prozess vom Gehirn Probenvorbereitung auf serielle Schnitte Bildgebung mit dem Knife-Edge-Scanning-Mikroskop, um Daten-Visualisierung und Analyse beschrieben. Diese Technik wird derzeit verwendet, um Maus-Hirn-Daten zu erfassen, aber es ist auf andere Organe, andere Arten.

Zusammenfassung

Große Fortschritte in hohen Durchsatz, hohe Auflösung, 3D-Mikroskopie-Techniken haben den Erwerb großer Mengen an neuroanatomischen Daten an Sub-Mikrometer-Auflösung aktiviert. Einer der ersten dieser Instrumente produziert Whole-Brain-Scale Data ist das Knife-Edge-Scanning-Mikroskop (KESM) ^{7, 5, 9,} entwickelt und gehostet in der Autoren-Labor. KESM hat Abschnitt und Bild ganze Gehirn von Mäusen auf Submikrometer Auflösung verwendet wurde, enthüllt die komplizierten Details der neuronalen Netzwerke (Golgi) ^{1, 4, 8,} Gefäßnetze (Tusche) ^{1, 4} und Zellkörper Verteilung (Nissl) ³ . Die Verwendung von KESM ist nicht auf die Maus noch das Gehirn beschränkt. Wir haben erfolgreich die Krake Gehirn ^6, Maus Lunge und Gehirn der Ratte abgebildet. Wir arbeiten derzeit an insgesamt Zebrafisch-Embryonen. Daten wie diese können viel zur connectomics Forschung ¹⁰ beitragen; die Mikrozirkulation und Hämodynamik Forschung; und Stereologie Forschung durch Rückstellungending eine exakte ground-truth.

In diesem Artikel beschreiben wir die Pipeline, darunter Probenvorbereitung (Fixierung, Färbung und Einbettung), KESM Konfiguration und Einrichtung, Schneiden und Bildgebung mit der KESM, Bildbearbeitung, Datenaufbereitung und Visualisierung von Daten und Analysen. Der Schwerpunkt wird auf die Probenvorbereitung und Visualisierung / Auswertung der gewonnenen Daten KESM werden. Wir erwarten, dass die detaillierten Protokoll in diesem Artikel vorgestellt werden, um zu erweitern den Zugang zu KESM und erhöhen ihre Auslastung.

Protokoll

1. Probenvorbereitung: Golgi-Cox

1. Dieses Protokoll lehnt sich eng an das Protokoll von Mayerich et al. ^7.
2. Die C57BL/6J Maus ist tief narkotisiert mit Isofluran inhalant Anästhesie und dann enthauptet.
3. Das Gehirn wird entfernt und in einen Golgi-Cox Fixierung Lösung (1% Kaliumchromat, 1% Kaliumdichromat und 1% Quecksilberchlorid in VE-Wasser) gelegt.
4. Das Gehirn ist in der Golgi-Cox-Lösung im Dunkeln gelassen, bei Raumtemperatur für 10 bis 16 Wochen.
5. Die Gehirne werden in deionisiertem Wasser über Nacht im Dunkeln gespült.
6. Die gespült Gehirn ist in 5% Ammoniumhydroxidlösung in VE-Wasser für 7 bis 10 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur eingetaucht. Dieser langwierige Vorbereitungszeit war die Infiltration des gesamten Gehirns zu gewährleisten, so dass der schwarze Niederschlag eine Chance, vollständig in das Gewebe zu bilden hatte.
7. Das Gehirn ist wieder in deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur gespült 4 Stunden und tHenne dehydriert durch eine abgestufte Reihe von Ethylalkohole: 50% und 70% in den Kühlschrank (4 ° C) und 85%, 95% (3 Änderungen), und 100% (4 bis 5 Änderungen) bei Raumtemperatur. Das Gehirn ist in jeder Lösung für 24 Stunden belassen.
8. Die entwässerten Gehirn ist dann in Aceton gelegt (3 bis 4 Änderungen, die jeweils für einen Tag), gefolgt von einem Araldit-Aceton-Gemisch mit Araldit-to-Aceton-Verhältnis von 1:2, 1:1, 2:1, und schließlich in 100% Araldit (3 ändert sich mit jedem über Nacht) im Kühlschrank (4 ° C).
9. Schließlich wird das behandelte Gehirn in 100% Araldit eingebettet und auf 60 ° C für 3 Tage (vgl. Einbettung Protokoll in Abbott und Sotelo ^2).
   Wenn die Proben in LR White eingebettet sind dann die Proben aus den letzten 100% Ethanol-Lösung durch drei Änderungen des LR White-Lösung, die jeder im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt, die eine Standard-Prozedur vor der Polymerisation übertragen wird. Drei Änderungen werden durchgeführt, um vollständige Infiltration gewährleisten. Die Probe wird tHenne auf frisches LR White, die in einem geschlossenen Behälter bei 60 polymerisiert ° C für 24 Stunden, die die erforderliche Menge von Zeit und Temperatur für die ordnungsgemäße Polymerisation wird.
10. Abb.. 1 zeigt ein Golgi-Cox gefärbten Gehirns in Araldite eingebettet.
11. Die ausgehärteten Probe Block wird dann auf dem Metall Probe Ring mit Epoxy angebracht, und die Seiten des Blocks abgeschnitten als notwendig (siehe Abb. 2)..

2. Probenvorbereitung: Nissl

1. Die Maus ist tief narkotisierten mit Ketamin und Xylazin (1,7 mg Ketamin / 0,26 mg Xylazin pro 20 Gramm Körpergewicht) intraperitoneal und dann perfundierten transkardial mit 50 ml Raumtemperatur Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), um 250 mL Platz, gefolgt Temperatur 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 7,4). und schließlich mit 3,0 ccm unverdünnt Tusche.
2. Die Ganzkörper-Perfusion mit Kochsalzlösung und Fixativ ist notwendig, um das Blut aus dem Herz-Kreislauf-System klar und auf den ti fix RAGEN. Perfusion mit Tusche ist notwendig, um vollständig zu füllen das Gefäßsystem des Herz-Kreislaufsystems.
3. Die daraus resultierende Gehirn wird dann durch eine Reihe von abgestuften Ethylalkohole (25% -100%) dehydriert und dann in Araldit Kunststoff nach dem Protokoll in 1,8-1,9 oben eingebettet. Wenn LR weiß ist das Einbettmedium dann das Protokoll in 1.10 oben folgt.

4. Probenvorbereitung: Generic Arten, generische Organe

1. Für den allgemeinen Fall, kann Fixierung mit entweder 10% neutral gepuffertem Formalin oder 4% Paraformaldehyd durchgeführt werden.
2. Für kleine Gewebe Volumen, ist die Diffusion statt Perfusion für die Fixierung und Färbung empfohlen. Im Fall von kleinen Organismen oder Organe können Verfärbungen auch während der Entwässerung Prozess gemacht werden.
3. Die Einbettung Protokoll ist das gleiche wie oben, obwohl die Zeiten für die Lösung Infiltration von Organen oder Organismen, die viel kleiner sind als ganze Gehirn der Maus reduziert werden kann.

jove_title "> 5. KESM Setup-und Imaging-

1. Pumpe ausschalten, auf der Bühne drehen, drehen vor der Kamera, drehen Sie am Illuminator.
2. Raise Messer und objektiv.
3. Installieren Probe Ring.
4. Measure Probe Dimension und eine Konfigurationsdatei für die KESM Bühne Controller2 Anwendung.
5. Starten KESM Bühne Controller2 und initialisieren Bühne.
6. Untermesser / Ziel, an der Pumpe ab.
7. Fokus Ziel und Kamera durch Drehen der Fokussierknopfes auf der optischen Bahn und Einstellen der Kamera das Sichtfeld des in Bezug auf die Messerschneide.
8. Drücken Sie auf [Start], um Imaging zu initiieren.
9. Siehe Abb.. 3-8. Siehe ^{9, 7} für technische Details.

6. Bildverarbeitung und-aufbereitung

1. Kopieren Sie die KESM Stack-Prozessor ausführbare Datei in den Ordner Data unter der Konfigurationsdatei Ordner (00000, 00001, etc.).
2. Führen Sie das KESM Stack-Prozessor für die Beleuchtung Artefakt zu entfernen und normalisieren die Hintergrund-Intensität in allenBilder. Wiederholen Sie dies für alle Daten Unterordnern.
3. Bereiten Multiskalen Fliesen aus dem Datensatz und Upload und Einrichten der Dateien in der KESM Brain Atlas Web-Server.
4. Siehe Abb.. 9.

7. Datenvisualisierung und-analyse

1. Visualisierung mit dem KESM Brain Atlas. Zum http://kesm.cs.tamu.edu und wählen Sie den entsprechenden Atlas.
   1. Navigieren Sie in Google maps.
   2. Zoom in und aus, wie in Google Maps.
   3. Um zu einer anderen Tiefe, wählen Sie, wie tief bei jedem Schritt aus dem Pull-Down-Menü gehen, und dann klicken Sie entweder auf [+] oder [-] zu erhöhen oder verringern z Tiefe.
   4. Passt die Overlay-Nummer über das Pulldown-Menü.
   5. Passt die Overlay-Intervall mit dem Pull-Down-Menü.
   6. Siehe Abb.. 11.
2. Visualisierung mit MeVisLab.
   1. Starten Sie MeVisLab.
   2. Erstellen Sie ein neues Projekt.
   3. Im Folgenden können neue Module, die von ty werden die Schaffungping in den Modul-Namen in der Befehlszeile ein.
   4. Neues Modul [Compose3Dfrom2DFiles], und gehen Sie auf den gewünschten Ordner. Geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie in string [GetFileList]. Achten Sie darauf, die ausgewählten Bilder können in den Speicher passen. Klicken Sie auf [Create3D] zu erstellen Volumen.
   5. Neues Modul [SetWorldMatrix], und stellen Sie die "Scale" unter "Elementare Transformationen" x, y, z die entsprechenden Voxelgröße (0,6, 0,7, 1,0 für eine 10X 0.45NA Ziel). Link [Compose3Dfrom2DFiles] bis [SetWorldMatrix].
   6. Set Matrix und Transformationen unter "Matrix Composition" auf "Ignorieren", "Ignorieren", "Forward".
   7. Neues Modul [Arithmetic1] und stellen Sie die "Function" auf "Invert (Max-Img)".
      Link [SetWorldMatrix] bis [Arithmetic1].
   8. Neues Modul [View3D] und connect [Arithmetic1].
   9. In View3D, während die rechte Maustaste gedrückt wird, bewegen Sie die Maus, um die Schwelle einstellen. Sie können Bilder zuschneiden Regionen, die Ausrichtung ändern (bewegen Sie die Maus, während linke Maustaste gedrückt ist), ändern Beleuchtung (Volumen-zeichnungeng oder MIP), on / off Hintergrund drehen, etc.
   10. Siehe Abb.. 10.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Hier präsentieren wir Whole-Brain-Daten und Details. Feigen. 12-15 zeigen, Whole-Brain Tusche, Golgi und Nissl Datensätze ^{1, 4, 3.}

Abbildung 1. Fixiert, gefärbt und eingebettete Gehirn der Maus

Abbildung 2. Embedded Maushirn Probe montiert auf die Probe Ring.

Abbildung 3. Der Knife Edge Scanning Mikroskop (KESM). Ein Foto des KESM ist mit seinen wesentlichen Komponenten markiert dargestellt: (1) High-Speed-Zeilenkamera, (2) Mikroskop-Objektiv, (3) Diamantmesser Montage-und Licht-Kollimator, (4) speCimen Tank (für Wasserlagerung imaging), (5) Drei-Achsen-Präzisions-Luftlagerung Bühne, (6) weiß-Lichtmikroskop-Hilfslicht, (7) Wasserpumpe (im Hintergrund) für die Entfernung von Gewebe geschnitten, (8) PC-Server für Bühne und Bildaufnahme, (9) Granitsockel, und (10) Granit-Brücke.

Abbildung 4. Imaging Prinzipien der KESM. Das Prinzip der Betrieb von KESM dargestellt. Das Ziel und das Messer ist an ihrem Platz gehalten, während die Probe auf die Positionierung der Bühne bewegt (Pfeil mit durchgezogener Linie) mit der Auflösung von 20 nm und Fahrgeschwindigkeit von 1-5 angebracht und wird auf der Diamant-Messer abgeschabt (5 mm breit für 10X-Objektiv) und erzeugt einen dünnen Abschnitt fließt über das Messer (Pfeil mit durchgezogener Linie). Line-Scan-Bildgebung ist in der Nähe der Spitze des Messers gemacht.

Abbildung 5. KESM Kamera und Objektiv Fokussierung steuert.

Abbildung 6. KESM Messeranordnung und Kontrollen.

Abbildung 7. Initial Fokussierung durch die Beobachtung Port.

Abbildung 8. KESM Bühne Controller 2-Applikation (Screenshot).

Abbildung 9. KESM Stack-Prozessor-Anwendung (Screenshot).

Abbildung 10. MeVisLab Anwendung (Screenshot).

Abbildung 11 KESM Brain Atlas:. Web-Schnittstelle (Screenshot).

Abbildung 12. KESM Whole-Brain Tusche Daten. Volume Visualisierungen KESM Daten Stacks sind für die vaskuläre Datensatz angezeigt. (A) Close-up des vaskulären Daten. Breite ~ 100 um. (Bd) Drei Standard-Ansichten des ganzen Gehirn der Maus Gefäßsystem (subsampled von Daten mit hoher Auflösung). Breite ~ 10mm.

Abbildung 13. KESM Whole-Brain-Maus Golgi-Daten.

Abbildung 14. KESM Golgi Daten Details.

Abbildung 15. KESM Whole-Brain Nissl Daten. (A) Close-up der NISSL Daten. ~ 300 UM ^3. (Bd) Drei Standard-Ansichten des ganzen Gehirn der Maus Nissl Daten (subsampled von Daten mit hoher Auflösung). Querschnitt für eine klare Sicht auf die internen Strukturen gezeigt.

Diskussion

Die KESM ermöglicht eine Sub-Mikrometer-Ebene Umfrage großer Mengen biologischer Proben (~ 1 cm ^3). Diese Art von Volumen reicht aus, um ganze kleine tierische Organe, wie Hirn, Lunge, Herz, Nieren halten, Scanned etc. Bilder von solcher Organe können beispiellose quantitative Informationen über die strukturelle Organisation dieser Organe vorsehen und ermöglichen rechnerische Modellierung der verschiedenen Funktionsbereiche Aspekte dieser Organe, einschließlich Schaltung und Netzwerk-Dynamik, elektrische Eigenschaften, Flüssigkeit und Luft Strömungsdynamik und muskulös Dynamik.

Die Probenvorbereitung Protokoll und post-Analyse-Protokolls in diesem Artikel beschrieben wird erwartet, dass außerhalb Arbeitsgruppen helfen, einen leichteren Zugang zu den KESM und die daraus resultierenden Daten zu haben. Die KESM Betrieb Protokoll wird dazu beitragen, diese externen Forschern, die Vorteile und Grenzen dieser einzigartigen Bildgebungsverfahren zu schätzen wissen.