MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

Zusammenfassung

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein wesentlicher zellulärer Mechanismus für die Regulation der Genexpression. Die Nutzung der angeborenen Kraft dieses System ermöglicht es uns, Knockdown Genexpression zu einem Verlust der Genfunktion Studien.

Es gibt zwei Methoden für die Durchführung von RNAi. Der erste ist der Einsatz von small interfering RNAs (siRNAs), die chemisch synthetisiert werden, und die zweite nutzt kurz-Haarnadel RNAs (shRNAs) innerhalb von Plasmiden ¹ kodiert. Letztere können in Zellen transfiziert direkt oder verpackt in Replikation inkompetent lentiviralen Partikeln. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von lentiviralen shRNAs ist die einfache Einführung in eine Vielzahl von Zelltypen, ihre Fähigkeit, stabil in das Genom für die langfristige Gen Knockdown und Auswahl zu integrieren, und ihre Wirksamkeit bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Verlust der Funktion Bildschirme. Um dies zu erleichtern haben wir die LentiPlex gebündelt shRNA Bibliothek erstellt.

Die MISSION LentiPlex Menschliche shRNA Pooled Library ist eine genomweite lentiviralen Pool produziert mithilfe eines firmeneigenen Verfahrens. Die Bibliothek besteht aus über 75.000 shRNA Konstrukte aus dem TRC-Sammlung Targeting 15.000 + menschlichen Gene ^2. Jede Bibliothek ist für shRNA Vertretung vor Produkt-Release getestet, um robuste Bibliothek Abdeckung zu gewährleisten. Die Bibliothek ist in einem ready-to-use lentiviralen Format bei Titer von mindestens 5 x 10 ⁸ TU / ml über p24-Test zur Verfügung gestellt und ist bereits aufgeteilt in zehn Unterpools von ca. 8.000 shRNA Konstrukte jeder. Amplifikation und Sequenzierung Primer sind auch für Downstream-Target-Identifizierung zur Verfügung gestellt.

Frühere Studien wurde eine synergistische Antitumor-Aktivität von TRAIL, wenn sie mit Paclitaxel in A549 Zellen, eine humane Lungenkarzinom-Zelllinie ^{3, 4} kombiniert. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendung von einer gepoolten LentiPlex shRNA Bibliothek schnell führen eine positive Auswahlbildschirm für Gene in die Zytotoxizität o beteiligtf A549-Zellen, wenn sie TRAIL und Paclitaxel ausgesetzt. Eine Hürde oft mit High-Throughput-Screens angetroffen wird die Kosten und Schwierigkeiten in Dekonvolution, wir haben auch ausführlich eine kostengünstige polyklonalen Ansatz mit traditionellen Sequenzierung.

Protokoll

LentiPlex Pooled Screen Setup

Zur Identifizierung shRNA-Sequenzen von Interesse ist es wichtig, die Einrichtung des Bildschirms, so dass die Mehrzahl der Zellen erhalten nur eine shRNA konstruieren. Durch die Verwendung einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion), ist die Wahrscheinlichkeit, mehrere Integranten pro Zelle deutlich verringert worden. Allerdings hängen Transduktion Effizienz und damit gewünschte MOIs, stark auf der Zielzelle aus. Daher ist es unerlässlich, dass die Bestimmung der optimalen MOI aus ist, bevor der Bildschirm in einer neuen Zelltyp durchgeführt.

1. Transduktion von Zielzellen mit der Mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek

1. Die tatsächliche MOI verwendet werden für verschiedene Zelltypen variieren. Wenn Wiederholungen sind erwünscht dann die Anzahl der Platten müssen entsprechend erhöht werden. Darüber hinaus, in der Regel ist es nicht vorteilhaft, die verschiedenen Unterpools kombinieren. Keeping the Unterpools separaten wird in der Entfaltung zu unterstützen. Stellen Sie sicher, proper Kennzeichnung jedes Gewebe Kulturschale mit dem Teilpool Zahl, die während der Transduktion angewendet wird. Eine niedrige MOI wird empfohlen, die Wahrscheinlichkeit einer multiplen Integranten pro Zelle zu reduzieren.
2. Tag 1 - Seed die entsprechende Anzahl von 60-mm-Platten mit genügend Zellen zu ~ 70% Konfluenz am folgenden Tag (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausfertigung = 30 Gerichte insgesamt durchgeführt) erhalten. Für unsere Studie wurden 60 mm Platten mit 6 x 105 A549-Zellen ausgesät zu einer Konfluenz von 70% vor der Transduktion zu erreichen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen noch in der exponentiellen Wachstumsphase. Die Wachstumsraten werden von Zelltyp variieren und müssen vor dem Start des Bildschirms bestimmt werden.
3. Lassen Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO ₂ zu halten.
4. (Optional) Fügen Sie zwei zusätzliche 60-mm-Platten für die Transduktion mit Negativ-Kontrolle shRNAs. Beschriften Sie die Gerichte "Control A" für SHC001H und "Control B" für SHC002H.
5. Tag 2 - transduzieren the-Zellen mit dem LentiPlex Viruspartikel. Am Tag der Transduktion, tauen die lentiviralen Partikeln auf Eis.
6. Übertragen Sie die aufgetauten Partikel zu einer Laminar-Flow-Haube und halten auf dem Eis, wenn nicht sofort verwendet wird.
7. Berechnen Sie, wie viel von jedem einzelnen viralen sub-Pool, um die Zellen hinzufügen, um den MOI von 1 in allen Zellkulturschalen zu bekommen.
   1. Beispiel: 1 x 10 ⁶ Zellen / Schale; virale Titer = 5 x 10 ⁸ TU / ml; eine gewünschte MOI von 1. i.) 1 x 10 ⁶ Zellen / Schale x (MOI von 1) = 1 x 10 ⁶ transduzierende Einheiten (TU) benötigt ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) aus der C erhalten A = 2 ul des lentiviralen Stammlösung sollte an die entsprechende Gericht hinzugefügt werden. Verdünnen Sie die berechnete Menge des Virus in 100-300 ul kompletter Medien, um eine bessere Verteilung des Virus, wenn die Zelle Kulturschale gegeben gewährleisten.
8. Entfernen Sie das Medium aus der Vor-ausgesäten Zellen. Add komplette Medien-containing Hexadimethrinbromid Lösung zu jedem Gericht. Die empfohlene Endkonzentration von Hexadimethrinbromid in Medien liegt bei 8 pg / ml. Verwenden Sie weniger Hexadimethrinbromid, wenn Sie es als toxisch für Ihre Zielzellen zu finden.
9. Add shRNA Lentivirale Partikel geeignete Gerichte in Übereinstimmung mit den vorgegebenen experimentellen Design. Vorsichtig schwenken die Platten gleichmäßig zu verteilen das Virus in den Zellen.
10. Inkubieren 18-20 Stunden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO _2.
11. (Optional) Wiederholen Sie 3-8 an der gleichen MOI mit SHC001H (Leervektor shRNA Control) in der Systemsteuerung Dish A und SHC002H (Rührei shRNA control) in Control Dish B. Behandeln Sie diese Gerichte identisch mit dem experimentellen Speisen während des ganzen Experiments.
12. Tag 3 - Ändern Sie die Medien. Saugen Sie Virus-haltigen Medien und fügen frische komplette Medien (ohne Hexadimethrinbromid). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C über Nacht.

2. Gönnen vernickeltZellen mit therapeutischen Komponente / Reagenz

1. Tag 4 - absaugen Medien aus Brunnen und fügen neue Medien mit therapeutische Komponente in der optimalen Konzentration. Wie bei Kulturbedingungen wird Behandlungen variieren und richtige Konzentration und Dauer sollte vorher bestimmt werden. In unserer Studie haben wir 100 ng / ml TRAIL und 1 uM Paclitaxel. Die Zellen wurden für 48 Stunden behandelt.
2. Die überlebenden Zellen sollten in T75 Flaschen erneut ausgesät werden und dürfen bis fast 100% konfluent zu erweitern.
3. (Optional) Am Ende der Auswahl, inspizieren Steuerung Dish A and Control Dish B. Dish A und B Dish sollte jeder haben weniger Kolonien als mindestens einer der zusammengefassten Bibliothek Gerichte. Wenn es eine unerwartet hohe Anzahl von Kolonien in Dish sind A, als entweder die Transduktion Prozess hat einen Weg im Zusammenhang mit dem gewünschten Phänotyp oder den selektiven Druck beeinflusst nicht intensiv genug ist und re-Optimierung des Assays kann erforderlich sein. Wenn Dish B enthält zu viele Kolonien, Dann Expression von shRNA und das Engagement der RNAi-Weg kann einen Einfluss auf den Phänotyp des Interesses. Wenn dies der Fall wiederholen mit SHC001H, um sicherzustellen, dass die Wirkung nicht spezifisch für SHC002H.

3. Dekonvolution von einer polyklonalen Zellpopulation

1. Ernten Sie die heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA. In unserer Studie wurden die Zellen kurz in PBS gewaschen und trypsiniert vor genomische DNA wurde unter Verwendung der GenElute Mammalian Genomic Miniprep Kit und versorgt Protokoll (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativ kann auch jede andere genomische Aufreinigungskits, die derzeit auf dem Markt für DNA-Isolierung verwendet werden. Es ist wichtig zu Protokoll Empfehlungen für den Grundbetrag von kultivierten Zellen folgen.
2. PCR-Amplifikation von Zielen. Die shRNA Vorlage Recovery-Prozedur ermöglicht Amplifikation des gesamten Pool von shRNA-Einsätze von der ausgewählten Zelle Bevölkerung oder das Abrufen von indiviDual shRNA Vorlagen aus Kolonien, die einzeln aufgenommen und erweitert worden. Nach der Verstärkung der shRNA Einsätze aus Kontrolle und ausgewählte Zielzellen kann die PCR-Produkte sequenziert werden.
3. Das PCR-Amplifikation Schritt wurde optimiert mit Sigma ReadyMix, Katalog-Nr P2893. Andere Reagenzien können zur Verstärkung eingesetzt werden, aber das Radfahren Bedingungen und / oder Magnesium-Konzentration Möglicherweise müssen Sie für eine erfolgreiche Amplifikation geändert werden. Amplifikationsprimer in der Konzentration 20 mM mit dem LentiPlex Kit enthalten.
4. Richten Sie die PCR-Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben. Fügen Sie die Komponenten in der aufgeführten Reihenfolge. Die beschriebenen Mengen sind für einen 50 &mgr; Reaktion. Weitere Reaktionen, Maßstab der Master-Mix-Komponenten durch die gewünschte Anzahl von Reaktionen und beinhalten 10% Überschuss. Die Menge an DNA-Template wird empfohlen 50-100 ng.
5. Es wird dringend empfohlen, die für eine Reaktion der Vorlage der MISSION shRNA menschliche Positive Control Vector verdünnt, um die appropr bestehtiate Konzentration. Erfolgreiche Amplifikation mit dieser Vorlage zeigt, dass die PCR-Assay-Komponenten und Radfahren Bedingungen angemessen sind. Hinweis: Um zu verhindern, Verschleppung der experimentellen Proben und Reagenzien, wird vorgeschlagen, dass die positive Kontrolle in einem separaten Ort, von dem anschließenden PCR-Reaktionen sind eingerichtet verdünnt werden.
6. Speichern Sie die PCR-Programm in Tabelle 2 in Ihre Thermocycler aufgeführt.
7. Für jede Probe kombinieren 3 ul PCR-Reaktion mit 1 ul Farbstoff und Elektrophorese neben 5 ul DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Ladder, Catalog Number D3687 auf einem 1% Agarosegel auf das Vorhandensein von einem 309 bp Amplikon zu bestätigen.
8. Subklonierung von PCR-Produkte: PCR-Produkte wurden TOPO kloniert mit dem TOPO-TA Cloning Kit nach Protokoll des Herstellers (Invitrogen, K4575-01). Das Ergebnis ist, dass man PCR-Produkt in jedem Vektor enthalten ist.
9. 250 Einzel-Bakterienkolonien (jeweils eine individuelle PCR Amplikon) wurden isoliert und wachsenn in 2 mL Kulturen LB mit 100 mg / mL Ampicillin. Plasmid-DNA wurde dann extrahiert mit der GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Gereinigte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI verdaut und elektrophoretisch auf das Vorhandensein des Einsatzes zu bestätigen.
11. Plasmid-DNA Proben wurden dann sequenziert und die shRNA einfügen, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank mit dem LentiPlex Bibliothek zur Verfügung gestellt.

4. Target-Identifizierung und-Validierung

1. Die shRNA-Sequenz initiiert mit 5'-GAAACACCGG-3 '. Geben Sie mindestens die nächsten 10, aber weniger als 21 Nukleotiden, wie die Abfrage-Sequenz in das Suchfeld auf der beiliegenden shRNA Sequenz Search Access-Datenbank zu bilden.
2. Wählen Sie die Art der gepoolten shRNA. Optional können Sie das Teilpool aus dem die Sequenz gefunden wurde.
3. Jetzt auf "Find Potenzielle Hits"-Taste, um die Suche durchzuführen klicken. Diese sollten die entsprechenden TRC shRNA-Sequenz (en), th Spiele-Sequenzierung Daten. Mehr Informationen über die TRC shRNA Sequenz (en) identifiziert und die entsprechenden Gen-Targets können ohne weiteres bei Sigma-Aldrich Your Favorite Gene gefunden werden: http://www.sigma.com/yfg
4. Identified Zielgene sollte durch Wiederholung der ursprünglichen Screening-Test mit dem Original TRC Klon plus mindestens zwei weitere shRNAs, dass das gleiche Gen mit einem 1 zu 1 shRNA-Well-Format Ziel validiert werden. Echte Hits zeigt den gleichen Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für eine LentiPlex gebündelt Bildschirm Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt sind. Transduzierten Zellen, die in Gegenwart von TRAIL und Paclitaxel vermehrt durften expandieren, bis Kolben wurden konfluent. Genomische DNA wurde geerntet und die PCR-Amplifikation und Klonierung, wie in Abbildung 1 dargestellt A, bevor sie für die Sequenzierung und shRNA Identifizierung vorgelegt, wie in Figu beschriebenre 1 C. 250 Klone wurden sequenziert, von diesen 25 wurden durch mehrere Klone vertreten und die restlichen 225 wurden nur um 1 Klon vertreten und wurden zu dieser Zeit nicht verfolgt.

Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden mehrere Kandidatengene einschließlich TBX3, PPP2CA und AKT2 durch mehrere Klone vertreten. Die T-box-Transkriptionsfaktor, erschien TBX3 in insgesamt vier Klone und hat in der Tumor-Migration ⁵ in Verbindung gebracht. PPP2CA Herunterregulation wurde gezeigt, dass das Wachstum von LNCaP-Zellen in Androgen-Mangel Bedingungen kultiviert durch Entlastung der Androgen-Deprivation-induzierten Zellzyklusarrest und Verhinderung von Apoptose ^{6 zu} halten. AKT2 ist ein RAC-beta Serin / Threonin-Proteinkinase und vermeintlichen Onkogen nachgewiesen, dass mehrere Rollen in der Entwicklung von Krebs ^{7, 8} zu spielen.

* Final Konzentration von Mg ^{2 +} in Lösung 3 mm betragen;1,5 mm von der Taq ReadyMix und 1,5 mm von der Magnesiumchlorid-Lösung beigetragen.
Tabelle 1. Lentiplex PCR-Reaktionsbedingungen

Tabelle 2. Lentiplex PCR Amplification Programm

Abbildung 1. (A) LentiPlex Bildschirm gebündelt, (B) Polyklonale Dekonvolution Workflow und (C) Identifizierung von shRNA Ziele.

A. LentiPlex gebündelt Bildschirm. Erstens Seed-Zellen, dann fügen Sie shRNA Unterpools, (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausführung durchgeführt, für 30 Gerichte insgesamt). Als nächstes mit therapeutischen Komponente / Reagenz (in unserem Fall, TRAIL und Pa behandelnclitaxel jeweils). Dann reseed überlebenden Zellen in Flaschen und damit zu erweitern. Ernte heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA.

B. Polyklonale Entfaltung. Führen Sie die PCR, DNA, welche die shRNA einfügen zu verstärken. Das PCR-Produkt ist eine einheitliche Größe, sondern polyklonalen in Folge seit der Vorlage gDNA wurde auch polyklonal. PCR-Produkt wird in den Vektor kloniert und anschließend in kompetente Bakterien transformiert.

C. Identifizierung von shRNA Ziele. Einzelne Kolonien werden isoliert und Plasmid-DNA wird extrahiert. Jeder Klon enthält den Klonierungsvektor mit einer einzelnen PCR-Fragment. Plasmid-DNA wird verdaut, um die Anwesenheit des Inserts sequenziert und zu bestätigen. Die shRNA Einsatz ist, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank.

Abbildung 2. Identifiziert werden könnenKandidatengene. 25 Kandidatengene identifiziert, hatte mehrere Treffer. 225 Kandidaten-Gene hatte nur 1-Hit und wurden nicht weiter verfolgt. Bitte beachten Sie Ergänzende Tabelle 1 für eine Aufschlüsselung der einzelnen Klone pro Kandidatengen.

Ergänzende Tabelle 1. Individuelle TRC-Bibliothek Klone aus polyklonalen Sequencing Gene ID identifizierte Hits Detected Clones.

Diskussion

In dieser Studie präsentieren wir eine genomweite Bildschirm, um Gene in Zytotoxizität von A549-Zellen nach Paclitaxel / TRAIL-Behandlung beteiligt sind. Die Verwendung einer gepoolten Ansatz in einer genomweiten Screen reduziert die Zeit, Kosten und Ausrüstungsinvestitionen in der Regel mit konventionellen angeordnet Bildschirmen verbunden. Entscheidend für den Erfolg des Bildschirms sind die Optimierung Experimente durchgeführt vorher. Transduction Bedingungen und MOI muss empirisch ermittelt werden.

Die Auswahl-Methode sollte für robuste Auswahl von Zellen, die den gewünschten Phänotyp (zB Überleben, Oberfläche Proteinexpression, etc) zu ermöglichen. Die Optimierung dieser Parameter wird die Anzahl der Fehlalarme erkannt.

Hier wurde gDNA von der Masse der Bevölkerung der ausgewählten Zellen geerntet und dann TOPO kloniert, um individuelle shRNA Einsätze zu identifizieren. Eine mögliche Verbesserung für dieses Experiment wäre es gewesen, für lebende Zellen mit FACS, um sicherzustellen, wählen Sie habendass nur lebende Zellen gesammelt werden. Die identifizierten Ziele werden durch Transduktion mit target-spezifischen shRNAs in einem Screening-Test bestätigt werden. Echte Hits zeigt den Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen.

Die LentiPlex Pooled-Bibliothek ist in seiner Anwendung flexibel. Es ist kompatibel mit einer breiten Palette von Downstream-Anwendungen und kann entweder mit positiven oder negativen Selektion Strategien verwendet werden. Abhängig von der Screening-Bedingungen, Entfaltung der shRNA-Einsätze erfolgt über PCR / Klonierung, Microarray-oder Next-Generation-Sequenzierung ^{9, 10} erreicht. Während die Leistung und Geschwindigkeit dieser Techniken, um RNAi-Screens Dekonvolution gut etabliert ist, eine Beschäftigung mit Microarray-und Next-Generation-Sequencing-Methoden ist die Verfügbarkeit der Bioinformatik Ressourcen und Wissen benötigt, um richtig zu analysieren und zu interpretieren experimentelle Ergebnisse. Die Kosten, die mit diesen Techniken kann oftmals ein Hindernis für die Verpflichtung von genomweiten Screens werden. APCR / Klonen Ansatz, die zwar nicht so leistungsfähig wie Microarrays und der nächsten Generation Sequenzierung ist eine effektive und kostengünstige Alternative.

Agilent bietet jetzt ein benutzerdefiniertes Feld auf dem TRC shRNA Bibliothek, um weiter in LentiPlex Bildschirme basieren. Diese Optionen ermöglichen es Forschern, LentiPlex verwenden, um ein breites Spektrum von zellulären Funktionen zu studieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549-Zellen	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	oductDetail.do? lang = en & N4 = T5694% 7CSIGMA & N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> P2893
GenElute Plasmid Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
Hexadimethrinbromid	Sigma-Aldrich	H9268