Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Zusammenfassung

Die Infektion von B-Zellen mit Epstein-Barr Virus (EBV) führt zu Vermehrung und anschließende Immortalisierung, was in Gründung lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) in vitro. Da LCL latent mit EBV infiziert sind, stellen sie ein Modellsystem zur EBV-Latenz-und Viren-driven B-Zell-Proliferation und Tumorgenese ^{1 Untersuchen.} LCL wurden verwendet, um Antigene in einer Vielzahl von immunologischen Assays ^{2, 3} zu präsentieren. Darüber hinaus können LCL verwendet, um humane monoklonale Antikörper ^{4, 5} zu erzeugen und eine potentiell unbegrenzte Quelle, wenn der Zugang zu primären biologischen Materialien ^{6, 7} begrenzt ist.

Eine Vielzahl von Methoden beschrieben worden, LCL generieren. Frühere Methoden haben den Einsatz von Mitogene wie Phytohämagglutinin, Lipopolysaccharid ⁸ enthalten, und Pokeweed mitogen ^9, um die Effizienz der EBV-vermittelte Immortalisierung zu erhöhen. In jüngerer Zeit haben andere immunosuppr verwendetEssiv Substanzen wie Cyclosporin A zu hemmen T-Zell-vermittelte Abtötung der infizierten B-Zellen ^{7, 10-12.}

Die beträchtliche Länge der Zeit von EBV-Infektion für die Niederlassung von Zelllinien treibt die Forderung nach schneller und zuverlässiger Methoden zur EBV-driven B-Zell-Wachstum Transformation. Mit einer Kombination aus hohen Titer EBV und ein Immunsuppressivum, sind wir in der Lage, konsequent zu infizieren, transformieren und erzeugen LCL von B-Zellen im peripheren Blut. Diese Methode verwendet eine kleine Menge von peripheren mononukleären Zellen, die in vitro-Cluster von Zellen infiziert sind, nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 mit EBV in Gegenwart von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum. Traditionell ist Auswuchs der proliferierenden B-Zellen durch Visualisierung der mikroskopischen Cluster von Zellen etwa eine Woche nach der Infektion mit EBV überwacht. Klumpen von LCL kann mit bloßem Auge nach einigen Wochen zu sehen. Wir beschreiben einen Assay zu bestimmen, vorzeitig, wenn EBV-vermittelte gachstum Transformation erfolgreich ist, auch vor der mikroskopischen Cluster von Zellen nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 ^hallo CD58 ^+-Zellen beobachtet, wie bereits drei Tage nach der Infektion zeigt ein erfolgreiches Ergebnis.

Protokoll

1. EBV Stoffaufbereitung

1. Subculture exponentiell wachsenden B95-8-Zellen (ATCC # CRL 1612; 13) auf 3 x 10 ⁵ Zellen / ml in einem 75 cm ² Zellkulturflasche mit sterilen Technik. Die Zellen werden in kompletten RPMI 1640 mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin / Streptomycin bei 100U/ml und 100 ug / ml, und Amphotericin B bei 0,5 pg / ml bei 37 ° C in der Gegenwart von 5% CO _2.
2. Achtundvierzig Stunden später, die Zellen in frisches vollständiges RPMI 1640 mit 1 x 10 ⁶ Zellen / ml. Zur Induktion Virus-Produktion stimulieren Zellen mit 20ng/ml Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA) für 1 Stunde in einem Standard-CO _2-Inkubator. Wash Zellen dreimal mit RPMI 1640 zu TPA zu entfernen.
3. Die Zellen in das ursprüngliche Volumen des kompletten RPMI 1640 (von 1,2) und der Kolben in CO _2-Inkubator für 96 Stunden. Diese Methode hat sich gezeigt, dass hohe Titer von infektiösen Virus par produzierenTeilchen ^6.
4. Zentrifugation bei 600 x g für 10 min bei 4 ° C zu EBV-haltigen Kulturüberstand von Zellen zu trennen. Filter Überstand durch ein 0,45-Mikron-Filter, Aliquot und bei -70 ° C über einem Jahr.
   Eine Alternative ist der Überstand von B95-8 Zellen mit EBV aus der ATCC (VR-1492) zu erhalten und den Einsatz bei der Verdünnung durch die ATCC empfohlen.

2. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)

1. Draw 10 ml Blut vom Spender in einer heparinisierten Spritze oder einer heparinisierten Blut Röhre. Verdünnen Sie das Blut mit 20 ml PBS bei Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen.
2. Underlay verdünntes Blut mit 15 ml Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedium. Zentrifugation bei 225 x g ohne Bremse bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
3. Entfernen Buffy-Coat und den Transfer in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Raise Volumen von 50 ml mit PBS und Spin bei 600 xg bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
4. Pour off Überstand. Wash-Zellen durch Resuspendieren Pellet in 50 ml PBS und Spinnen bei 600 x g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wash zweimal in ähnlicher Weise.
5. Resuspendieren gewaschenen Zellen in 1 ml vollständigem RPMI. Verwenden Sie 5 ul der Zellen zu einer 1 / 10 Verdünnung in Trypanblau vorzubereiten. Graf lebenden Zellen mit Hilfe einer Zählkammer.
6. Die Lautstärke mit komplettem RPMI in einer 25 cm ² Zellkulturflasche auf eine Zellkonzentration von 2 x 10 ⁶ / ml erhalten.

3. Eine Infektion mit EBV

1. Add FK506 (AG Scientific) zur Zellsuspension von 2,6 auf eine Endkonzentration von 20 nM. Küvette in CO _2-Inkubator bei 37 ° C für eine Stunde.
2. Schnell Tauwetter ein Aliquot von EBV. Entfernen Flasche aus Inkubator und fügen EBV zu den Zellen in 1 / 10 Verdünnung. In der Regel bietet diese Verdünnung einer MOI von 50-100. Swirl Kolben zu mischen und legen Sie sie aufrecht in CO _2-Inkubator bei 37 ° C.

Hinweis thIn Schritt 4 durchgeführt, um Erfolg vorherzusagen, ist ein optionaler Schritt. Wenn Schritt 4 ausgeführt werden soll, müssen Sie eine zusätzliche Flasche un-infizierten PBMC bei 2 x 10 ⁶ Zellen / ml als Kontrolle inkubiert.

4. Identifizieren proliferierenden Zellpopulation (optionaler Schritt)

1. Bereiten FACS-Puffer: PBS + 5% FBS. Lagerung bei 4 ° C.
2. Nehmen Sie die folgenden Antikörper mischt in 50 ul Volumen jeweils zum Färben von Zellen in Schritt 4.6. Antikörper-Verdünnungen sollten in FACS-Puffer mit 1mg/ml von Maus-IgG (Sigma) auf nicht-spezifische Bindung von Antikörpern hemmt werden.
   1. Single-gefärbt mit PE-konjugierte anti-CD23-Antikörper (1 / 50 Verdünnung)
   2. Single-mit FITC-konjugierte anti-CD58-Antikörper (1 / 50 Verdünnung)
   3. Single-gefärbt mit PE-Cy5-konjugierte anti-CD19-Antikörper (1 / 50 Verdünnung)
   4. Triple-gefärbt CD23, CD58 und CD19 (1 / 50 Verdünnung jeder)
   5. Single-gefärbt mit PE konjugiert IsotypkontrolleAntikörper abgestimmt auf CD23-PE (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD23-Antikörper)
   6. Single-mit FITC konjugiert Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf CD58-FITC (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD58-Antikörper)
   7. Single-gefärbt mit PE-Cy5 konjugiert Isotypkontrollantikörper auf abgestimmt CD19-PE-Cy5 (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD19-Antikörper)
   8. Triple-gefärbt mit allen drei Isotypkontrolle Antikörper.
   Vorübergehend speichern mischt bei 4 ° C im Dunkeln.
3. In dem dritten Tag nach der Exposition mit EBV, schwenken Kolben zu erhalten eine gleichmäßigere Zellsuspension. Entfernen Sie 2ml von Kolben in ein 2ml Eppendorf-Röhrchen. Spin Rohr in einer Mikrozentrifuge mit 3000 rpm bei Raumtemperatur für 3 Minuten.
4. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in FACS-Puffer bei 5 x ^Oktober von 06 bis 1 x 10 ⁷ Zellen / ml.
5. Entfernen Sie acht 50 ul Aliquots in einzelne Eppendorf-Röhrchen oder einer 96-Well V-Bodenplatte. Spin-Röhrchen oder die Platte bei 1500 x gfür 3 Minuten.
6. Überstand verwerfen und Wirbelrohren / Platte. Die Zellen in jedes Röhrchen / well in 50 ul FACS-Puffer mit geeigneten Antikörper-Verdünnungen in 4,2 vorbereitet.
7. Die Röhrchen / Platte auf Eis im Dunkeln für 30 Minuten. Centrifuge Zellen bei 3000 rpm für 3 Minuten, entfernen Sie den Überstand und 200 ul FACS-Puffer. Centrifuge Zellen wieder und entfernen Überstand der Wäsche komplett. Wiederholen Sie zwei weitere Wäschen.
8. Die Zellen in 200 ul FACS Puffer und Daten erfassen mit einem Durchflusszytometer, Erwerb 20.000 Events / Rohr.
9. Analysieren von Daten mit WinMDI (freeware für FACS Datenauswertung am PC). Tor auf lebende Zellen mit Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profilen. Dann Tor lebenden Zellen für die Expression von CD19 ⁺ (B-Zell-Marker) nach einem Vergleich mit Zellen, die mit Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf anti-CD19-Antikörper gefärbt. Plot CD19 ⁺ Live-B-Zellen mit Fluoreszenz-Intensität für CD23 auf der x-Achse und Fluoreszenzintensität für CD58 auf der y-Achse. Bestimmen CD23 ⁺ und CD58 ^+-Zellen durch einen Vergleich mit EBV-exponierten Zellen mit aufeinander abgestimmten Isotypkontrolle Antikörpern gefärbt. Anwesenheit von CD23 ^+-Zellen CD58 ^hallo in EBV-exponierten Kultur (Abbildung 2C) prognostiziert erfolgreiche Auswuchs der EBV-infizierten Wachstum transformierten Zellen. Im Gegensatz dazu CD23 ^hallo CD58 ^+-Zellen nicht entstehen, wenn Zellen nicht zu EBV (Abbildung 2A) ausgesetzt sind oder ausgesetzt zu einem nicht verewigen Stamm EBV (Abbildung 2B). CD23 CD58 ^{+-Zellen hallo} wurden experimentell nachgewiesen, dass die Proliferation zu unterziehen und anschließend zu etablieren LCL (14).

5. Expansion und Kryokonservierung von LCL

1. Visualisierung von Zellen durch Lichtmikroskopie: Durch eine Woche nach EBV-Infektion, sind Cluster von Zellen sichtbar unter dem Lichtmikroskop. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der frühen mikroskopischen Cluster (Abbildung 3B) in einem Kolben.
2. Mit fortschreitender Zeit werden mikroskopische Cluster größer, so dass Klumpen sind sichtbarmakroskopisch in den Kolben. 3C zeigt größere Cluster von Zellen in etablierte LCL mittels Lichtmikroskopie.
3. Feeding-Zellen: Doppelte Volumen Kulturmedium in der Kulturflasche am Tag 12. Anschließend erweitern Kultur durch eine Erhöhung der Lautstärke 2-3 fach mit komplettem RPMI.
4. Die Periodizität der Fütterung Zellen sollten auf der Grundlage von Zellwachstum bestimmt werden. Wenn das Kulturmedium gelb wird, ist es in der Regel Zeit, um die Medien wie oben ersetzen. In der Regel tritt diese einmal pro Woche. Jedoch können einige Zelllinien müssen mehr oder weniger häufig gefüttert werden. Expand Kultur 75-100 ml in den nächsten paar Wochen.
5. Kryokonservierung: Beim Einfrieren unten Zellen, Zentrifuge Zellen bei 600 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in kaltem Einfriermedium mit 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid bei 1 x 10 ⁷ Zellen / ml. Das Röhrchen in flüssigem Stickstoff.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Erfolgreiche Bilanz wird durch die Anwesenheit von CD23 ^+-Zellen CD58 ^hallo vorhergesagt. Etwa 2-3% der lebenden Zellen an Tag 3-4 nach Exposition gegenüber EBV sollte das Profil (Abb. 2C). Andere Sub-Populationen von CD23 ^+, CD23 ^-, CD58 ⁺ und CD58 ^- Zellen beobachtet nach der Exposition gegenüber EBV zeigen minimale Proliferation ^14. Un-infizierten Zellen (Abbildung 2A) und Zellen, die EBV von HH514-16-Zellen (Abbildung 2B), Beherbergung einer nicht verewigen Stamm EBV, zeigen nicht CD23 ^hallo CD58 ^+-Zellen.

Sie können auch visualisieren Zellen unter dem Lichtmikroskop zu Erfolg zu überwachen: Wie bereits erwähnt, innerhalb einer Woche nach EBV-Infektion, sind kleine Gruppen von Zellen in der Flasche sichtbar durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 3B). Mit fortschreitender Zeit und Zellen in LCL entwickeln, werden mikroskopisch kleine Cluster größer (Abbildung 3C), so dass Klumpen zu sehen sind makroskopisch in den Kolben.

Abbildung 1. Workflow zur Erzeugung und Kryokonservierung von lymphoblastoiden Zelllinien. Periphere Blut wird durch einen Ficoll-Gradienten zentrifugiert. PBMC in der Buffy-Coat eines etablierten Gradienten sind FK506 durch Zugabe von EBV gefolgt ausgesetzt. EBV-exponierten Zellen werden bei 37 ° C in Anwesenheit von 5% CO ₂ zu errichten und anschließend zu erweitern LCL für die Kryokonservierung gewachsen.

Abbildung 2. Identifizierung einer Subpopulation von B-Zellen erwartet, dass die Proliferation nach Exposition mit EBV zu unterziehen. Un-infizierten PBMC (A) oder PBMC ausgesetzt EBV abgeleitet von HH514-16-Zellen (B) oder von B95-8-Zellen (C) in Gegenwart von FK506 wurden am Tag 3 geerntet. Die Zellen wurden mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen CD19, CD23, CD58 und Regie gefärbt. Nach Gating auf lebenden Zellens, un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B und C) CD19 ⁺ B-Zellen wurden für die Expression von CD23 und CD58 untersucht. Eine Subpopulation von B-Zellen, die CD58 und ein hohes Maß an CD23 (CD23 ^hallo CD58 ^+), beobachtet nur in den Zellen, die Transformation kompetenter EBV (abgeleitet von B95-8-Zellen), dargestellt ist.

Abbildung 3. Visualisierung der Zellhaufen in EBV-infizierten Zellen. PBMC wurden mit FK506 behandelten und infizierten mit EBV. Un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B) Zellen wurden untersucht 1 Woche nach der Infektion durch Phasenkontrast-Mikroskopie (10fache Vergrößerung). Fünf Wochen alte lymphoblastische Zellinie ist in C gezeigt

Diskussion

Die Methode in diesem Papier beschrieben erzeugt LCL vom Spender peripheren Blut mit schnellen Immortalisierung und Kryokonservierung Zeiten. Durch den Einsatz von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum, und hohe Titer von infektiösen Viren sind wir in der Lage, die Proliferation der EBV-infizierten B-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen zu fördern. Diese Eingriffe machen das beschriebene Verfahren effizienter zu gestalten, was zu einer raschen Expansion von Zellen für die nachfolgenden Experimente.

Traditionell wurde das Wachstum Transformation durch Visualisierung von Clustern von Zellen unter dem Lichtmikroskop etwa eine Woche nach der Exposition gegenüber EBV ^{6, 15} überwacht. Allerdings ist Clustering von Zellen, die nicht einer bestimmten Indikator für EBV-vermittelte Wachstum Transformation. Wir haben früher die konsistente Identifikation der proliferierenden Zellpopulation über Durchflusszytometrie ¹⁴ gezeigt, und bietet eine genaue und spezifische Methode zur erfolgreichen Ergebnis so früh zu bestimmen, wie 3 Tage nach achterner Exposition der B-Zellen, die EBV.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Firma	Katalog-Nummer
Amphotericin B	Fisher BioReagents	BP 928-250
Dimethylsulfoxid	Sigma	D 2650
Rinderfötenserum, hitzeinaktiviertem	Sigma	F 4135
Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedien	Mediatech	25-072
FK506	AG Scientific	F 1030
IgG aus Maus-Serum	Sigma	I 8765
Maus anti-human CD23 konjugiert PE	BD Pharmingen	555711
Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE	BD Pharmingen	554680
Maus anti-human CD58 konjugiert FITC	Pierce Thermo Scientific	MA1-82159
Maus Isotyp IgG1 FITC konjugiert	BD Pharmingen	550616
Maus anti-human CD19 konjugiert PE-Cy5	BD Pharmingen	555414
Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE-Cy5	Dako	X 0955
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140-122
RPMI 1640 Medium	Sigma	R 8758
Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA)	Calbiochem	407952
FACS-Puffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% fötalem Rinderserum)