Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt die Protokolle der intrinsischen optischen Signalen und Flavoproteinen Autofluoreszenzsignale Bildgebung zur Karte Gerüche hervorgerufene Aktivitäten auf der Oberfläche der Riechkolben bei Mäusen.

Zusammenfassung

Im Gehirn aktiviert sensorische Stimulation Populationen von Neuronen unter funktionalen Modulen, die die Codierung der Reiz teilnehmen verteilt. Funktionelle optische bildgebende Verfahren sind vorteilhaft, um die Aktivierung der einzelnen Module im sensorischen Kortex mit hoher räumlicher Auflösung sichtbar zu machen. In diesem Zusammenhang sind endogene optische Signale, die von molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit neuroenergetics entstehen wertvolle Quellen Gegensatz zu räumlichen Karten von Sinnesreizen über weite Felder in der Nagetier Gehirns aufzuzeichnen.

Hier stellen wir Ihnen zwei Techniken, die auf Veränderungen der endogenen optischen Eigenschaften des Hirngewebes während der Aktivierung basiert. Zuerst wird die intrinsische optische Signale (IOS) werden von einer lokalen Veränderung in rot Lichtreflexion durch hergestellt: (i) Absorption durch Veränderungen in Blutoxygenierung Ebene und Blutvolumen (ii) Photonenstreuung. Die Verwendung von in vivo IOS zu räumlichen Karten aufzeichnen begann Mitte 1980 mit dem observatiauf der optischen Karten Whisker Fässer in der Ratte und der Orientierung Spalten in der Katze visuellen Kortex ^1. IOS Bildgebung von der Oberfläche der Nager wichtigsten olfaktorischen Bulbus (OB) in Reaktion auf Geruchsstoffe wurde später von Larry Katz Gruppe ² demonstriert. Der zweite Ansatz setzt auf Flavoprotein Autofluoreszenzsignale (FAS) auf Grund von Änderungen in den Redox-Zustand der mitochondrialen Stoffwechsel-Zwischenprodukte. Genauer gesagt, ist die Technik auf der grünen Fluoreszenz durch oxidierte Zustand der Flavoproteinen, wenn das Gewebe mit blauem Licht angeregt basiert. Obwohl solche Signale wurden wahrscheinlich unter den ersten fluoreszierende Moleküle für die Untersuchung der Aktivität des Gehirns durch die Pionier-Studien von Britton Chancen und Kollegen ³ aufgezeichnet, war es bis vor kurzem nicht, dass sie für die Kartierung des Gehirns Aktivierung in vivo verwendet worden sind. FAS Bildgebung wurde zum ersten Mal den somatosensorischen Kortex bei Nagetieren als Reaktion auf Hinterpfote Stimulation durch Katsuei Shibuki Gruppe ⁴ aufgebracht.

Das olfaktorische System ist von zentraler Bedeutung für das Überleben von der überwiegenden Mehrheit der Lebewesen, weil es effiziente Detektion und Identifizierung von chemischen Stoffen in der Umwelt (Nahrung, Räuber) ermöglicht. Der OB ist die erste Staffel von olfaktorischen Informationsverarbeitung im Gehirn. Er empfängt afferente Projektionen aus dem olfaktorischen primären sensorischen Neuronen, die flüchtigen Duftmoleküle erkennen. Jede Riechzelle drückt nur eine Art von Geruchsrezeptoren und Neuronen tragen die gleiche Art von Rezeptor schicken ihre Nervenfortsätze die gleiche, wohldefinierte Mikroregionen von ~ 100 um ³ gebildet aus diskreten Neuropil, die olfaktorische Glomeruli (Abb. 1). In den letzten zehn Jahren hat IOS Abbildung der funktionalen Erforschung des OB ^{5, 6, 7,} die sich zu einem der am besten untersuchten sensorischen Strukturen unterstützt wurde. Die Abbildung von OB Aktivität mit FAS Bildgebung wurde noch nicht durchgeführt.

Hier we zeigen die aufeinanderfolgenden Schritte eines effizienten Protokoll für IOS und FAS Bildgebung durch Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus OB Karte.

Protokoll

1. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung (in Einklang mit den europäischen Empfehlungen zur Pflege und Verwendung von Labortieren, 86/609/EWG Richtlinie)

1. 6 bis 8 Wochen alt C57BL6 männlichen Mäusen werden betäubt mit einem Cocktail von Ketamin (10mg/kg) und Xylazin (100mg/kg) injiziert intraperitoneal. Chirurgie beginnt, wenn die Maus nicht mehr reagiert Prise Hinterpfote. Während des gesamten Experiments wird das Tier auf einem Heizkissen gelegt. Die Körpertemperatur wird kontinuierlich überwacht und bei 37 ° C. Tiefe der Narkose während der Operation und Imaging-Sitzung, indem Sie aus dem Fehlen von Gliedmaßen zurückzutreten gepflegt. Eine subkutane Injektion von 20% der anfänglichen Betäubung Cocktail ist nichts anderes verwaltet.
2. Mit Klipper, entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut. Reinigen Sie die unbedeckte Haut aus Rest-Haar mit steriler Gaze mit Kochsalzlösung getränkt.
3. Platzieren Sie die Maus in der stereotaktischen Rahmen. Die Schnauze ist in der gleichen Ebene wie die Rückseite des Kopfes werden,Um die Oberfläche des olfaktorischen Bulbus der horizontalen gesetzt. Sichere fest an Ohr und Nase Bars, um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern.
4. Übernehmen Augensalbe auf die Augen des Tieres zu trocknen und Schmerzen zu verhindern.
5. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 ° Ethanol und die Kopfhaut mit aufeinander des betadine.
6. Um die Haut über den Schädel zu entfernen, indem ein Schnitt in der Haut mit einer Schere an der Rückseite des Kopfes zwischen den Ohren beginnen. Dann auf beiden Seiten in Richtung der Basis des Ohres und in der ap-Richtung auf die Stirn entlang der Augenlider abgeschnitten. Fertig Entfernen der Kopfhaut, indem man die Haut auf der Oberseite der Schnauze dicht an die Nase bar.
7. Unter binokulare Beobachtung, verwenden Sie ein Wattestäbchen mit Kochsalzlösung getränkt, um sanft lösen das Periost auf der Oberseite des Schädels. Verwenden Sie eine Pinzette, um die restlichen Gewebe zu entfernen und kratzen die Oberfläche des Schädels mit einem Skalpell, um eine saubere Vorbereitung haben.
8. Der OB ist eine symmetrische Struktur von zwei hemibulbs, die zwischen den Augenlidern befinden sich zusammensetzen. Sie sind in der rostralen und in den kaudal durch einen venösen Sinus begrenzt, und getrennt von der Pfeilnaht. Legen Sie ein Stück aus resorbierbaren Gelatineschwamm mit destilliertem Wasser auf den Knochen über dem OB getränkt. Es ist wichtig, dass dieser Knochen Bereich feucht während des gesamten Experiments.

2. Vorbereiten des kranialen Fenster

1. Entfernen Sie die Gelatineschwamm und starten, indem Sie vorsichtig Schaben der Knochen mit n ° 10 Skalpell. Halten Sie einen konstanten Winkel von 45 ° zwischen der Klinge und der Knochen, und bewegen Sie die Klinge von den Lidern auf die sagittale Seite der Glühbirne Bereich. Wenden Sie keine vertikalen Druck auf den Knochen oder kratzen den Knochen oberhalb des venösen Sinus.
2. Während der Durchforstung Prozess zu stoppen alle 5min und Ort eines hydratisierten Gelatineschwamm am Knochen zur Abkühlung der Vorbereitung. Swab den Schädel mit dem Schwamm zu Knochen Staub zu entfernen.
3. Keep Kehr-undKühlung alternativ bis die Visualisierung der Trabekel, die Spongiosa Schicht. Die feinen Gefäße des OB muss sichtbar sein in dieser Phase. Stoppen Sie kratzen den Knochen, und starten Sie mit dem Skalpell die Spitze senkrecht zu "zeichnen" einen rechteckigen Bereich umschließt der OB. Zu diesem Zeitpunkt n ° 11 Skalpell eingesetzt werden kann. Halten Sie die Operation innerhalb der Grenzen der venösen Sinus, die sicher von jedem Skalpell Schlaganfall sollte.
4. Dig allmählich gebildeten rechteckigen Graben durch aufeinanderfolgende Bewegungen des Skalpells. Wischen Sie die Spitze des Skalpells in regelmäßigen Abständen zu reinigen und halten Sie sie scharf. Seien Sie besonders vorsichtig von der Tiefe der Spitze zu vermeiden, berühren die Dura Oberfläche.
5. Um einen Eindruck von der Dicke des verbleibenden Knochens zu erhalten, drücken Sie ihn sanft mit der Spitze einer Pinzette. Wenn der Knochen Klappe Falten unter Druck, um den nächsten Schritt zu bewegen.
6. Unter einem Tropfen Kochsalzlösung, mit der Spitze des Skalpells horizontal ausgerichtet zu heben den Knochendeckel. Das Entfernen der Klappe ist zu tun c werdenarefully zu vermeiden Abreißen der restlichen Knochen.
7. Nachdem die OB-Oberfläche ausgesetzt ist, für das Fehlen von Blutungen oder Blutgefäße Anastomose zu überprüfen. Verletzung der Dura oder der Gewebeoberfläche verringert die Chancen auf optische Signale. Wischen Sie den Bereich mit einer Gelatine-Schwamm in Kochsalzlösung getränkt, um die Lampe feucht zu halten.
8. Übernehmen Polyacrylat Zahnzement zu einem gut auf den Knochen bilden sich rund um das Fenster.
9. Geben Sie einen Tropfen niedrigen Schmelzpunkt Agarose (1,2%) über die Laufzeit, und legte eine sterile Abdeckung Glas an die Abmessungen des Fensters. Während der Bildgebung Sitzung kann eine kleine Menge Agarose zugegeben, um das Austrocknen zu kompensieren. Agarose wird der OB von bewegten sich mit der Atmung zu verhindern und eine ebene Fläche für die optische Bildgebung bieten.

3. Optical Imaging-Setup für olfaktorische Aktivität Mapping

1. Die olfaktorische Stimulation muss genau in Zeit und Intensität werden durch den Einsatz von einem Olfaktometer definiert. Wir verwenden eine benutzerdefinierte modifizierte Version des multivial Perfusionssystem Valvebank 8II aus Automatisieren Scientific mit einer grundlegenden Luftkompressor (komprimierte Atemluft wäre so gut geeignet ist) verbunden. Dieses System ermöglicht eine präzise und schnelle externe Ventilsteuerung. Lösungen von reinem Geruchsrezeptoren sind in Mineralöl bei der gewählten Konzentration verdünnt. Zur Aktivierung des dorsalen OB Aldehyde wie Hexanal werden häufig verwendet. Eine genaue Volumen des verdünnten Geruchsstoff (20 bis 50 ul) befindet sich auf einem Filterpapier geladen und in eine Spritze Reservoir. Durch die Perfusion System wird der Druck kontrolliert Luft in das System geliefert, wodurch eine konstante odoriert Luftströmung Lieferung an das Tier Nase während Ventilöffnung. Odorant wird durch eine Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) Tragluft bei einer Flussrate von ~ 1000ml/min geliefert. Vermeiden Sie die Kontamination zwischen Geruchs-und Restmengen von Geruchsrezeptoren in den Schlauch. Falls verfügbar, können die Reproduzierbarkeit der Geruchsstoff Reiz contro werdenullt durch den Einsatz von einem Flammenionisationsdetektor (microFID 2020 Photovac).
2. Der optische Aufbau ist eingeschaltet. Es besteht aus einem gekühlten interlaced 12 Bit CCD-Kamera (ORCA AG Hamamatsu) mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Leica MZ16), einem Computer gesteuert Olfaktometer und stabilisiert Anregungslampen mit entsprechenden Bandpass-Interferenzfilter verbunden. Ein Schema beschreibt unser Setup ist in Abbildung 2 dargestellt. Für intrinsische optische Signale Imaging (IOSI), eine 200W Halogenlampe (Oriel QTH) mit einem Faserring Licht (Schott) gekoppelt gesteckt um das Mikroskop-Objektiv verwendet werden, um stabile und gleichmäßige Ausleuchtung gewährleistet. Für Flavoprotein Autofluoreszenzsignale Imaging (FASI), ein 150W Halogenmetalldampflampe (Leica) mit einer 5mm Kernflüssigkeit Lichtleiter bieten auch lokale Anregung der Fluoreszenz durch die Auflicht-Port des Stereomikroskop.

   Bildaufnahme-und Hardware-Synchronisation werden von kundenspezifischer Software realisiert. Die offene suelle Software Mikromanager kann auch verwendet werden, um den optischen Aufbau und Übernahme zu kontrollieren.

4. Die optische Bildgebung

1. Setzen Sie den stereotaktischen Rahmen unter dem Stereomikroskop, der Schädelbasis-Fenster in der Mitte des Sichtfeldes (siehe Abb.. 2A eine schematische Darstellung des optischen Aufbaus).
2. Tune dem Mikroskop auf die Kapillaren zu konzentrieren. Vor Stimulation Studien (siehe Beschreibung in 5) ein Bild der Lampe ist unter 560nm (grün) Licht (Faserring), die einen guten Kontrast für Blutgefäße Imaging bietet übernommen. Dieses Bild wird als eine anatomische Kontrolle verwendet werden, um den Stand der Vorbereitung zu überprüfen und erworben wird mehrmals während des Experiments.
3. Für IOS Bildgebung, reflektierte Lichtintensität durch die CCD-Kamera unter 630 + / -10 nm (rot) Beleuchtung aufgenommen. Die Bilder werden in Full-Frame (kein Binning) mit 5 Bildern pro Sekunde, was zu einer Belichtungszeit von etwa 150 ms entsprechen erworben. Leistung der Lichtquelle eingestellt wird, um wieder ach Graustufen von mindestens ~ 3000 auf dem OB-Bereich, nahe der Sättigung des CCD Pixel Brunnen. Dies macht es möglich, die Vorteile der 12 Bit Dynamik des CCD zu ergreifen, um schwache Intensität Veränderungen bei der Aktivierung erfasst. Maximale IOS Amplituden erreichen ~ 1%.
4. Für FAS bildgebenden Fluoreszenz unter Anregung von 480nm + /-20nm (blau) epiflurorescence Licht erworben. Ein High-Pass-Filter bei 515 nm ist, um Licht einzufangen gesetzt. Die Bilder sind mit 5 Bildern pro Sekunde mit einer Binning von 4 mal 4, um die Empfindlichkeit zu maximieren erworben. Anregungslichtleistung ist ähnlich IOS mit Graustufen von 3000 auf dem OB-Bereich angepasst. Maximale FAS Amplituden erreichen ~ 3%.

   Für beide bildgebenden Verfahren ist die Schärfentiefe in der Betreff-Ebene die gleiche und wurde auf 0,5 mm für eine Vergrößerung von etwa 4-mal gemessen.

5. Licht sollte off zwischen bildgebenden Studien gedreht werden, um zu vermeiden Heizung und Bleichen der Zubereitung.

le "> 5. Imaging-Studien

1. Standard-Imaging-Sitzung umfasste eine Grundlinie von 5 bis 10s, wo nur Luft zugeführt wird, gefolgt von der Duftpuls für 3 bis 10s je nach gewähltem Geruchskonzentration, und 70 bis 82s sind weiter mit einem konstanten Luftstrom, um grundlegende Erholung (Abb. aufgezeichnet 2A). Am Ende des Versuchs wird das Licht ausgeschaltet und reine Luft ist für die inter-Studie Intervalldauer geliefert (1 bis 3 Minuten) zum Auswaschen Rest Geruchsmoleküle und vermeiden sensorischen Gewöhnung. Odor Versuche wurden mit leeren Studien (Luftzufuhr) verschachtelt.
2. Odor-evozierte aktivierten Zonen werden visualisiert, wie etwa sphärische Bereiche auf den Karten und entsprechen der Größe der einzelnen Glomeruli (80 bis 200 um im Durchmesser ^9). Bildverarbeitung ist in Abbildung 2B erläutert. Olfaktorische Karten sind in Abbildung 3 dargestellt. Im Gegensatz zu anderen sensorischen Systems, war das Signal-Rausch-Verhältnis in der OB aus, um Geruchs-evozierte Potentiale in einzelnen Studien zu lösen (Abb.. 3B für IOS und Bild. 3D für FAS).
3. Mäuse sind unmittelbar nach dem Ende der Bildgebung Sitzung mit Methoden in Einklang mit den europäischen Empfehlungen zur Pflege und Verwendung von Labortieren eingeschläfert.

6. Repräsentative Ergebnisse (siehe olfaktorischen Karten in Abbildung 3):

Abbildung 1 Strukturelle Organisation der wichtigsten Riechkolben in Nagetieren. Riechzellen, primäre Sinneszellen in der Haupt-Riechepithel befindet, drücken die gleichen Geruchsrezeptoren und konvergieren auf die gleichen Glomeruli in der OB. Olfaktorische Glomeruli, die runden Neuropile (gestrichelte Kreise), an der Oberfläche der OB entfernt. Beachten Sie, dass eine sehr dichte und komplexe vaskuläre Netzwerk vorhanden an der glomerulären Ebene ist. Abkürzungen (oben / unten): ONL: Riechnerv Schicht; GL: glomerulären Schicht, EPL: externe plexiformen Schicht; MCL:Mitral-Zellschicht, GCL: Körnerzellschicht.

Abbildung 2 Reflexions-und Fluoreszenz-Signale Aufnahme in vivo. A. Weitwinkel-optische Bildgebung Setup. Das Gehirn einer narkotisierten Maus ist entweder rot (IOS) oder blau (FAS) Licht entweder durch eine ringförmige Faserring an der Optik Linse oder ein Auflicht-Port eines Mikroskops ausgesetzt. Gerüche werden in versiegelten Ampullen geladen und odoriert Luft ist, um das Tier Nase geliefert (grünes Licht: geöffnetem Ventil). B. Die Aufnahme-Protokoll und Datenverarbeitung. IOS und FAS sind als Reihe einzelner Studien (90s Dauer) aufgezeichnet. Das Diagramm zeigt die Timeline einer einzigen Studie: baseline variiert von 5 bis 10 s, Stimulation von 3 bis 10s, und zurück auf den Ausgangswert von 70 bis 82s. Bildverarbeitung erfordert pixel-by-Pixel-Subtraktion der Intensitätswerte während der Baseline, um die Intensität Werte in Zeiten der Stimulation (für FAS) or Stimulation und wieder auf den Ausgangswert (für IOS). Diese Differenz wird dann durch Baseline-Werte aufgeteilt, um eine Veränderung in% zu erhalten (siehe resultierenden Bilder in Abb.. 3).

Abbildung 3 Odor-evozierte Aktivität Karten in der OB mit IOS und FAS Bildgebung. A. Gefäßsystem des dorsalen OB visualisiert unter grünem Licht. BC. IOS abgebildet (single-Studie versus drei gemittelten Studien jeweils) für ein 10s-Präsentation von 20% Hexanal. Weiße Pfeile zeigen die sphärische regions of interest von diesem Geruch aktiviert. Diese Aktivierung Karten wurden unter Verwendung der Frames gemittelt während der ersten Sekunde nach dem Ende des Geruchs-Stimulation (maximal Reflexion Variation -0,63% in A und -0,52% in B). Beachten Sie die schwarzen Zonen der Absorption, wo Geruch Aktivierung stattgefunden hat. CD. FAS erworben nacheinander in der gleichen Maus für den gleichen Duftstoff (single-Studie versus drei gemittelten Studien jeweiligenly). Diese Aktivierung Karten wurden unter Verwendung der Frames gemittelt während der ersten Sekunde nach dem Beginn der Geruch Stimulation (maximal Fluoreszenz Variation +0,72% in D und +0,66% in E). Beachten Sie, dass die weißen Zonen der Autofluoreszenz-Emission durch schwarze Pfeile gekennzeichnet, die schwarzen Zonen in IOS entsprechen. Die körnige Aspekt in der FAS Karte zu sehen ist aufgrund der 4 x 4 Binning für die Verbesserung der Empfindlichkeit erforderlich. FAS Bilder wurden nicht von Autofluoreszenz Bleichen korrigiert. Tatsächliche Abmessungen von Bildern BE: 0,7 mm breit x 1,2 mm lang.

Diskussion

In diesem Artikel präsentieren wir IOS und FAS bildgebende Verfahren zur In-vivo-Aufnahmen von Geruchs-evozierten Aktivitäten in der Maus OB. Um dieses Ziel zu erreichen eine relativ einfache und preiswerte Weitwinkel-optische Bildgebung Setup notwendig ist. Die Akquisition von Bilddaten erfordert Übung, um die feinen chirurgische Eingriffe und vermeiden Sie jegliche Verletzung der Dura oder Hirngewebe. Insbesondere wird schwerer Blutungen absorbieren Photonen für die Bildgebung erfasst und am Ende des Experiments.

Ein Vorteil der IOS und FAS-Bildgebung ist die Injektion von fluoreszierenden Tracern, die in zelluläre Toxizität oder unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten, zu vermeiden. Sie machen es möglich, Fragen über olfaktorische Karten somit räumliche Kodierung von Sinnesreizen anzugehen. Im Gegensatz zu 2-Desoxyglucose Bildgebung bieten sie die Möglichkeit, Bild mehrere Gerüche in einem einzigen Tier. Da Photonen Eindringen in das Gewebe begrenzt ist, sind IOS und FAS an der dorsalen Teil des OB beschränktund kann nicht vom ventralen Regionen aufgenommen werden.

Endogene optisches Signal Imaging bietet eine ausgezeichnete räumliche Auflösung bei der in-vivo-Bildgebung. Technische Verbesserungen betreffen quantitative Berechnungen der vaskulären Komponenten in der Reflexionssignale ^8,9 sowie Dynamik des Blutes mit Sauerstoff und Lautstärke während sensorische Aktivierung ^10. Multiwavelength Bildgebung von IOS bildgebenden Verfahren sind derzeit in unserem Labor entwickelt, um vollständig zu quantifizieren totale Hämoglobinkonzentration und die Sauerstoffversorgung in den OB während der sensorischen Aktivierung. Diese spektroskopischen optische Messungen hinzugefügt, um FAS Bildgebung wird die Möglichkeit geben, die ungelöste Beziehung zwischen Gefäß-und intrazellulären Dynamik beim sensorischen Aktivierung ^11,12 beantworten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des The Regent	Firma	Katalog-Nummer
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Agarose, Typ III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115606-100ML