Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

Zusammenfassung

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll für In vivo Studien an Tieren. Wir beschreiben, wie rAAVs im Labor hergestellt werden können und wie diese Vektoren können titriert, um eine genaue Ablesung der Anzahl der infektiösen Partikel produziert zu geben.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) sind zunehmend wertvoll für in vivo Studien an Tieren und sind auch derzeit in klinischen Studien am Menschen getestet. Wildtyp-AAV ist ein nicht-pathogenen Mitglied der Parvoviridae Familie und Natur replikationsdefizient. Die breite Transduktion Profil, geringe Immunantwort sowie die starke und anhaltende Transgenexpression mit diesen Vektoren erzielt hat sie ein beliebtes und vielseitiges Werkzeug für die in vitro und in vivo Gentransfer. rAAVs können einfach und billig im Labor hergestellt und auf ihre günstige Sicherheitsprofil basieren, sind in der Regel eine geringe Sicherheit Klassifizierung gegeben. Hier beschreiben wir eine Methode für die Produktion und Titrierung von chimären rAAVs mit dem Kapsid-Proteine ​​sowohl AAV1 und AAV2. Der Einsatz dieser sogenannten Chimären-Vektoren kombiniert die Vorteile beider Eltern Serotypen wie hohe Titer Aktien (AAV1) und Reinigungdurch Affinitätschromatographie (AAV2). Diese AAV-Serotypen sind die besten von allen AAV-Serotypen untersucht und individuell über ein breites Infektiosität Muster. Die chimären Vektoren hier beschriebene sollte die infektiösen Eigenschaften der AAV1 und AAV2 und kann somit erwartet, dass eine Vielzahl von Geweben, einschließlich Neuronen, Skelettmuskel, Bauchspeicheldrüse, Nieren ua zu infizieren. Die hier beschriebene Methode nutzt Heparin-Säule Reinigung, glaubte eine Methode, um eine höhere Virustiter und sauberer Viruspräparats als andere Reinigungsmethoden, wie Zentrifugation durch ein Cäsiumchloridgradienten geben. Zusätzlich beschreiben wir, wie diese Vektoren schnell und einfach titriert werden, um genaue Lektüre der Anzahl der infektiösen Partikel produziert zu geben.

Protokoll

Siehe Abbildung 1 für eine Illustration der Zusammenfassung der folgenden Protokoll.

Sicherheitshinweis: Alle Materialien, die in Kontakt mit montiertem viralen Partikel wurde muss mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel desinfiziert werden.

1. Herstellung von Plasmid-DNA Aktien (~ 2 Tage)

1. Die folgenden Plasmide sind ¹ erforderlich:
   • PRV1 - mit dem AAV2 Rep und Cap-Sequenzen
   • PH21 - mit dem AAV1 Rep und Cap-Sequenzen
   • pFdelta6 - Adenovirus-Helfer-Plasmid
   • AAV-Plasmid enthaltend das rekombinante Expressionskassette AAV2 Verpackung Signale (inverted terminal repeats, ITR) flankiert
2. Während pFdelta6 in Stbl2 kompetente Zellen gezüchtet werden sollten, um partielle Deletion zu verhindern, können PRV1 und PH21 in DH5alpha kompetente Zellen gezüchtet werden. AAV-Plasmiden können in Stbl2 Zellen gezüchtet werden, wenn partielle Deletionen in DH5alpha Zellen vorkommen.
3. Plasmid-DNA von hoher Qualität und frei von RNA Verunreinigungen sein. Plasmide können für Integrität mit folgenden Übersichten zu sehen sein:
   • PRV1 - Verdau mit XbaI zu geben Bands von 7,5 kb und 3,8 kb
   • PH21 - Verdau mit EcoRI Bands von 4,5 kb, 2,8 kb und 0,2 kb geben
   • pFdelta6 - Verdau mit HindIII Bands von 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb und 1,5 kb geben

2. Vorbereitung von humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) Zellen zur Transfektion (2 bis 3 Tage)

1. Platte zwei 80% konfluente 150 cm ² Flaschen HEK293-Zellen in fünf 15 cm Durchmesser Nunc Gewebekulturschalen. Die Zellen sind 70 - 80% konfluent vor der Transfektion (etwa 48 Stunden nach dem Ausplattieren). Kultur-Zellen in Standard-Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit niedrigen Glukose mit 10% fötalem Kälberserum und 100 U / ml Penicillin / 100 ug / ml Streptomycin.
2. 3 Stunden vor der Transfektion entfernen DMEM und ersetzen mit Iscove'S modifiziertes Dulbecco Medium (IMDM) mit 5% fötalem Kälberserum.

3. Die Transfektion der viralen Plasmiden (~ 1 Stunde für die Transfektion, 3 Tage Inkubation)

1. Bereiten Sie die folgenden für eine einzelne Charge (5 x 15 cm Zellkulturplatten) des Virus:
   • 62,5 pg AAV-Plasmid
   • 125 &mgr; g pFdelta6
   • 31,25 pg PRV1
   • 31,25 pg PH21
   • 1650 ul 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. In der Klasse 2 Gewebekultur Haube Sterilfilter die Transfektion Mischung in eine 50 ml Tube.
3. Während Vortexen der Lösung schnell hinzufügen 13 ml 2 x HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,05). Ersetzen Deckel 50 ml Tube und weiter Wirbel für 15 Sekunden. Lassen Sie für 1 Minute 45 Sekunden stehen, sollten sich ein feiner weißer Niederschlag bilden.
4. Vorsichtig mit 5 ml der Transfektion Lösung für jede 15 cm Gewebe Kulturschale. Swirl Platten zu mischen und zum Inkubator.
5. 16 Stunden nach der Transfektion entfernen IMDM-Medium und ersetzen mit DMEM.

4. Lyse der Zellen und die Ernte von rAAVs (2 Stunden)

1. 72 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie Medien aus Zellkultur-Platten und entsorgen. Alle Abfälle sollten mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel behandelt werden.
2. Vorsichtig waschen die Zellen in warmem 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).
3. 25 ml warmem PBS zu jeder Platte und entfernen Sie vorsichtig Zellen mit einem Zellschaber. Sammeln Suspension in 50 ml Tuben.
4. Pellet-Zellen bei 800 xg für 10 Minuten.
5. Überstand verwerfen und Pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, verwenden Sie 10 ml pro Gewebekulturplatte. Aufgeteilt in zwei 50 ml-Tuben.
6. Bereiten Sie eine frische Lösung von 10% Natriumdeoxycholat in dH ₂ O. Add 1,25 ml dieser zu jedem Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,5%. Add Benzonase Nuklease um eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter. Mix Rohr gründlich.
7. bei 37 ° C für 1 Stunde.
8. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3000 xg für 15 Minuten. Transfer zum frischen 50 ml Tube, sicherzustellen, dass alle Zelltrümmer entfernt wurde, um zu verhindern Sperrung von Heparin-Säulen (siehe Schritt 5). In diesem Stadium können die Proben bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren werden. Wir haben Proben für mehrere Wochen bei -20 ° C ohne eine Reduktion der Infektiosität gespeichert.

5. Heparin Säule Reinigung von rAAVs (2 bis 3 Stunden)

1. Setup-HiTrap Heparin-Spalten mit einer Schlauchpumpe, so dass Lösungen fließen durch die Säule mit 1 ml pro Minute für Schritte von 5,2 bis 5,4. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Heparin-Säule eingeführt werden.
2. Äquilibrieren der Säule mit 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
3. Übernehmen 50 ml Virus-Lösung in die Spalte und lassen ungehindert durchfließen.
4. Wash Säule mit 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
5. Mit einem 5-ml-Spritze weiterhin die Spalte w waschenit 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, mit 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gefolgt. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
6. Mit 5 ml Spritzen und sanften Druck eluieren das Virus aus der Säule durch die Anwendung:
   • 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • Sammeln Sie diese in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen.

6. Konzentration und Sterilfiltration von rAAVs (1 Stunde)

1. Konzentrieren Vektor mit Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Einheiten mit einem 100.000 Molekulargewichtsschnitt. Legen Sie 4 ml Eluat in den Konzentrator und Zentrifuge bei 2000 xg für 2 Minuten (bei Raumtemperatur). Discard Durchfluss und reload-Konzentrator mit den restlichen Virus-Lösung und wiederholen Zentrifugation. Die konzentrierte Volumen sollte ca. 250 ul werden. Wenn konzentrierte Volumen ist deutlich mehr als diese, verwerfen den Fluss turch und weiterhin in 1 Minute Schritte Zentrifuge bis beläuft sich auf rund 250 ul.
2. Add 250 ul PBS, um Viren zu einem Endvolumen von 500 ul und entfernen von Konzentrator.
3. Filter-Vektor durch eine 13 mm Durchmesser 0,2 &mgr; Spritzenfilter. Vector sollten aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt.

7. Titrierung von viralen Aktien (3 Tage)

Dies erfordert ein Promotor, der aktiv in HEK293-Zellen Fahren ein Reporter-Gen oder ein immuncytochemisch nachweisbar Genprodukt ist. Bei der Herstellung eines Vektors, die nicht kompatibel mit HEK293-Zellen anderer Zelllinien oder primäre Zellkulturen verwendet werden kann.

1. Bereiten 18 Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen oder 18 Vertiefungen Nunc Kammer gleitet durch Impfen HEK293-Zellen, so dass sie 40 sind - 50% konfluent. Für die Titration von Cre-abhängigen rAAVs Verwendung HEK293-Zellen, die stabil exprimieren die Cre-Rekombinase ^2.
2. Infect jede Vertiefung mit serieller dilutions des AAV-Vektors (Abb. 2A). Verwenden Sie 3 Vertiefungen pro Verdünnung. Wir routinemäßig add Virus direkt in jede Vertiefung.
3. Nach 72 Stunden fix HEK293-Zellen durch Zugabe des gleichen Volumens von 4% Paraformaldehyd (PFA) bis mittel (was eine Endkonzentration von 2% PFA) für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Wash Zelle dreimal in PBS, in dH ₂ O und Deckglas spülen.
5. Zählen Sie die Anzahl der transduzierten Zellen aus den drei Brunnen, die den höchsten Verdünnungsfaktor haben, aber immer noch enthalten infizierten Zellen, den Durchschnitt dieser und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der infektiösen Einheiten pro Mikroliter (Abb. 2B) zu geben.

8. Erwartete Ergebnisse

HEK293-Zellen transduziert mit einem Virus kodiert Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) in Abbildung 2B dargestellt sind. Wir in der Regel eine konsistente Titer von etwa 6 x 10 ⁶ infektiöse Partikel pro Mikroliter. Wir verwenden routinemäßig diese Vektoren für stereotaktische injektion in die Erwachsenenwelt Nagetier Gehirn. Dies bietet eine leistungsstarke Technik für Region-spezifische Genexpression ^2. Um diese Region Spezifität mit Zell-Typ selektive Genexpression spritzen wir die Rekombinase Cre-abhängigen rAAVs in Zielregionen der Cre-transgenen Mäusen ² kombinieren. Abbildung 2C-E zeigt Beispiele für stereotaktische Injektion von Cre-abhängigen rAAVs Kodierung eGFP in verschiedenen Hirnregionen der Erwachsenenbildung Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen ^3.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls für rAAV Produktion. . 1) HEK293-Zellen sind vernickelt und wuchs auf 70 bis 80% Konfluenz. 2). AAV und Helferplasmide sind bereit und in HEK293-Zellen transfiziert. 3). Medium ist wieder DMEM 16 Stunden nach der Transfektion verändert und HEK293-Zellen sind für weitere 56 Stunden kultiviert. 4). HEK293-Zellen werden geerntet und lysiert. rAAV-Vektoren sind aus Zelltrümmer durch c getrenntentrifugation. 5). Virale Partikel werden durch Heparin Spalten vor Konzentration und Sterilisation gereinigt. 6). HEK293-Zellen werden auf 24-Well-Platten gewachsen und infizieren mit seriellen Verdünnungen des AAV-Vektors auf die Anzahl der infektiösen Einheiten zu bestimmen.

Abbildung 2. Titrierung und in vivo Anwendung der rAAV1 / 2. (A) Setup von HEK293-Zellen für die Messung virale Titer. HEK293-Zellen mit seriellen Verdünnungen von rAAVs transduziert. C, nicht infizierten Kontrolle; N, 1 ul unverdünnter virale Lager. (B) HEK293-Zellen mit rAAVs Ausdruck eGFP infiziert. (CE) Viral eGFP-Expression beschränkt sich auf Cre-exprimierenden Neuronen in verschiedenen Zielregionen Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen nach stereotaktische Injektion von Cre-activated rAAVs. Beispiele Bilder zeigen GFP-Immunreaktivität in (C) der retikulären Thalamus und Globus pallidus (D) Gyrus dentatus und (E) der CA1 Region des Hippocampus. DG, dentate Gyrus; RT, retikuläre Thalamuskern; GP, globus pallidus. Maßstabsbalken: B, 500 pm, C, 100 pm, D, 100 pm, E, 500 um.

Diskussion

rAAV-Vektoren sind immer wertvoller für in vivo Studien an Tieren. Hier haben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Herstellung rAAVs beschrieben, die möglicherweise die breite Anwendung dieses nützlichen Vektor durch die Vermeidung von teuren Outsourcing-Virus-Produktion für Unternehmen zu erleichtern. Das Protokoll (basiert auf Referenz 1) beschreibt die Herstellung von Chimären rAAV1 / 2 Vektoren, die Kapsidproteine ​​von beiden Eltern-Serotypen bei gleicher Übersetzungen ^4. Die Reinigung der rAAV-Vektoren durch die Bindung an Heparin Säulen stützt sich auf die Expression von AAV2 Kapsidproteine, kann aber mit den Serotypen außer AAV1 hier skizzierten kombiniert werden. Darüber hinaus hat AAV6 wurde berichtet, dass an Heparin zu binden, allerdings mit einem geringeren Affinität, und könnte mit Heparin Spalten mit diesem Verfahren ^5,6 gereinigt werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass auch andere Serotypen werden verschiedene Konzentrationen von NaCl für Heparin Säulenelution ^{5,7 erfordern.}

Packaging rAAV Genome konnte gezeigt werden, zwischen 4,1 und 4,9 kb optimal mit einem deutlichen Rückgang in der Verpackung Wirkungsgrad von bis zu 5,2 kb ^8. Diese Verpackung Grenze kann als der größte Nachteil des rAAV-System, da Zelltyp-spezifische Regulation der Transgenexpression ist in der Regel von großen cis wirkende Elemente, die nicht in den kleinen AAV-Partikeln untergebracht erreicht werden kann. Zur Überwindung niedrige Titer Chargen, wie jene, die sich aus dem Versuch, Paket Gene, die in der Nähe des AAV Verpackung beschränken wir die Kombination von getrennten viralen Chargen konzentriert, um 250 ul in eine 500 ul Charge werden, anstatt das Hinzufügen PBS wie in Schritt 6.3 beschrieben werden. Zuverlässige Zelltyp-spezifische Transduktion durch die Kombination Cre-Fahrer Mäusen und bedingte rAAV-Kassetten (siehe unten) zu vermeiden, Dehnen der Verpackung Grenze erreicht werden.

Zu beachten ist, während dieses Protokoll versucht, easy-to-folgen Sie den Anweisungen auf der Produktion von qualitativ t lieferniter rAAV, bedarf es der Anwesenheit von AAV2 Kapsidprotein-Reste für die Reinigung von Heparin-Affinitätschromatographie. Serotypen außer AAV2 muss gereinigt mit alternativen Verfahren ⁹ sein. Ein Vorteil des Heparin-Säule Reinigung ist es geglaubt wird, um AAV-Vektoren, die größer Infektiosität als diejenigen unter Verwendung eines Cäsiumchloridgradienten ¹⁰ haben zu produzieren. Es gibt jedoch auch einige Nachteile dieser Methode. Zum Beispiel können andere Proteine, die Heparin-Bindung auch in der gereinigten viralen Lager. Während des Tropismus von Heparin-gereinigten Vektoren, die durch den Vektor-Titer ^10, unser Ansatz, gezielt entweder erregend ²⁰ oder hemmende Neuronen (Abb. 2) beeinflusst werden kann beschäftigt Cre-induzierte Aktivierung von AAV-vermittelte Transgenexpression und Titer-unabhängig. Eine Alternative zu Heparin-Säule Reinigung ist die Verwendung eines Iodixanol Dichtegradienten, die eine höhere Virustiter und reiner Vorbereitung als die Verwendung von produzierteinen Cäsiumchloridgradienten ^10. Diese Methode kann auch mit Heparin-Säule Reinigung kombiniert werden, um einen Vektor, der größer als 99% reinem ¹¹ ist zu produzieren. Daher erfordert sorgfältige Abwägung von den einzelnen Gruppen, welche virale Reinigungsverfahren ist am besten für ihre jeweilige nachgeschaltete Antrag.

Das häufigste Problem mit diesem Protokoll ist gering virale Titer. Nach unserer Erfahrung kann dies in der Regel zu geringe Transfektionseffizienz oder die Elution des Virus aus dem Heparin-Säulen zurückgeführt werden. Alle Transfektion Materialien sollten bei Raumtemperatur vor der Transfektion werden, und testen Transfektionen durchgeführt werden, um die optimalen Bedingungen in jedem Labor zu finden. Andere Methoden der Transfektion, wie Lipofektamin sind hocheffiziente, kann aber teuer werden. Darüber hinaus ist die Konzentration und pH-Wert des Heparin-Säule Elutionslösungen von entscheidender Bedeutung für eine vollständige Elution der Virionen von Heparin Spalten ohne C.ut Schaden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Verpackung Zellen müssen gut haften an der Oberfläche des Gewebes Kulturschalen. Wenn die Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu lösen während des Verfahrens ist es ratsam, das Experiment und Abtauung eine neue Flasche von Zellen zu beenden.

Räumlich-zeitliche Kontrolle der Transgenexpression in Nagetieren ist leicht durch genaue anatomische Ausrichtung und das Entwicklungsstadium der Tiere erreicht. Effiziente AAV-vermittelte Gentransfer in utero ^12,13 gezeigt. Im erwachsenen Gehirn, kann die Fläche mit rAAV-Partikel nach stereotaktische Injektion infiziert von sehr kleinen Zielregionen, um viel größere Gebiete, die nicht nur durch Änderungen in der virale Titer, sondern auch durch die Veränderung der Injektion Parameter eingestellt werden. Dazu gehören das Volumen und die Geschwindigkeit der Injektionen und die Einbeziehung der Polyol-Mannit mit der Virussuspension ^14. Mannitol kann auch zur Infektion von einer Vielzahl von Geweben nach systemischer rAAV Injektion ¹⁵ erhöhen ^</ Sup>.

Die Verpackung Kapazität von rAAV (ca. 4,7 kb) ist wahrscheinlich der limitierende Faktor in Bezug auf die Gene, die aus dieser viralen Vektoren ausgedrückt werden kann. Allerdings haben neuere Studien gezeigt, dass diese teilweise durch Spaltung größere Gene oder Expressionskassetten werden in separate rAAV-Vektoren zu überwinden und die Einführung eines Bridging-Sequenz, die Einleitung der Genexpression bei Virionen der gleichen Zelle ¹⁶ zu infizieren. Expression von Genen durch rAAV-Vektoren durchgeführt können auch stark mit sich selbst kostenlos rAAV-Vektoren ¹⁷ erhöht werden. Stereotaktische Injektion von rAAV-Vektoren bietet eine schnelle, kostengünstige und leistungsfähige Methode zur Induktion der Genexpression in einer Region spezifische Art und Weise. In Kombination mit der ^2. Generation der RNA-Interferenz-Strategien ¹⁸ rAAVs können auch für regional spezifische Gen-knock down verwendet werden. rAAVs mit Cre-transgenen Mäusen oder Zelltyp-spezifische Promotoren kombiniert werden, um Leistungs-und Zell-Typ zu erreichen-Spezifische Gen-Expression, erlauben genetische Manipulationen mit hoher räumlicher Auflösung ^2,19-21, während Montage rAAVs z. B. mit der Tet-System fügt zeitliche Kontrolle über Virus-vermittelten Genexpression ^22,23. Diese Beispiele zeigen die enorme kombinatorische Potential dieser Vektoren und sagen eine rasche Zunahme der rAAV-basierte Studien über die Jahre zu kommen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Amicon Ultra Filterzentrifugen	Millipore	UFC810024	100.000 MWCO
Benzonase-Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco s modifiziertem Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	10567014	Supplement mit 10% FCS und 10 Einheiten / ml penicillin/100 ug / ml Streptomycin
HEK293-Zellen	American Type Culture Collection	CRL-1573	Verwenden Sie bei dem Durchgang weniger als 30
HEPES gepufferte Salzlösung	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Heparin Patrone	Sigma-Aldrich	54836
Iscove-modifiziertes Dulbecco-Medium	Invitrogen	12440-053	Supplement mit 5% FCS
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D5670	Machen Sie frische Lösung für jede Charge
15 cm Tissue Kulturschalen	Fisher Scientific	157150
Stbl2 kompetenten Zellen	Invitrogen	10268-019
Virkon Lösung	Fisher Scientific	NC9821357	Lassen Sie zu desinfizieren Nacht vor der Entsorgung zu entwässern