Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Zusammenfassung

Die reverse Genetik für die Rift Valley-Fieber-Virus MP-12 Impfstamm ist ein nützliches Werkzeug für die Schaffung zusätzlicher MP-12-Mutanten mit erhöhter Dämpfung und Immunogenität. Wir beschreiben das Protokoll zu erzeugen und zu charakterisieren NSs Mutanten.

Zusammenfassung

Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV), die hämorrhagisches Fieber, neurologischen Erkrankungen oder Erblindung bei Menschen, und eine hohe Rate Abtreibung und fetale Missbildungen bei Wiederkäuern ¹ bewirkt hat als HHS / USDA eingestuft überschneiden wählen Agent und eine Risikogruppe 3 Erreger. Es gehört zur Gattung Phlebovirus in der Familie Bunyaviridae und ist einer der bösartigsten Mitglieder dieser Familie. Mehrere reversen Genetik-Systeme für den RVFV MP-12 Impfstamm ^2,3 sowie Wildtyp-RVFV Stämme ^4-6, einschließlich ZH548 und ZH501, seit 2006 entwickelt worden. Der MP-12-Stamm (das ist ein Risiko, Gruppe 2 Erreger und einem Nicht-wählen-Agent) ist stark gedämpft durch mehrere Mutationen im M-und L-Segmente, aber trägt noch virulent S-Segment RNA ^3, die eine funktionelle Virulenz kodiert Faktor, NSS. Die rMP12-C13type (C13type) tragen 69% in-frame-Deletion von NSS ORF fehlt allen bekannten NSs Funktionen, während es als effic repliziertient ebenso wie MP-12 in VeroE6 Zellen ohne Typ-I-IFN. NSs induziert eine Abschaltung von Host-Transkription einschließlich Interferon (IFN)-beta mRNA ^7,8 und fördert Abbau von doppelsträngigen RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) in der post-translationalen Ebene. ^9,10 IFN-beta ist transkriptionell hochreguliert durch Interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB und Aktivator-Protein-1 (AP-1), und die Bindung von IFN-beta zu IFN-alpha/beta Rezeptor (IFNAR) stimuliert die Transkription von IFN-alpha Gene oder anderen Interferon-stimulierten Genen (ISGs) ^11, welcher Host antivirale Aktivitäten induziert, während Host Transkription Unterdrückung einschließlich IFN-beta-Gen von NSS verhindert das Gen upregulations dieser ISGs in Reaktion auf die virale Replikation, obwohl IRF-3, NF-kB und Aktivator Protein-1 (AP-1) kann durch RVFV7 aktiviert werden. . So ist NSs ein hervorragendes Ziel weiter dämpfen MP-12 und zum Host angeborenen Immunantwort durch die Abschaffung der IFN-beta Unterdrückung Funktion zu verbessern. HierWir beschreiben ein Protokoll zur Erzeugung eines rekombinanten MP-12-Codierung mutierte NSS und liefern ein Beispiel für ein Screening-Verfahren auf NSS-Mutanten fehlt die Funktion, IFN-beta-mRNA-Synthese zu unterdrücken identifizieren. Zusätzlich zu ihrer wesentlichen Rolle in der angeborenen Immunität, ist der Typ-I IFN für die Reifung von dendritischen Zellen und die Induktion einer adaptiven Immunantwort ^12-14 wichtig. So induzieren NSs Mutanten-Typ-I IFN sind weiter abgeschwächt, aber gleichzeitig sind effizienter zu stimulieren Host Immunreaktionen als Wildtyp-MP-12, die sie zu idealen Kandidaten für die Impfung Ansätze macht.

Protokoll

1. Rückgewinnung von rekombinanten MP-12-Codierung NSs Mutation (en) von Plasmid-DNA ²

1. Spread-Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK) / T7-9-Zellen ^15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase, in 6-cm-Schalen in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Kat. Nr. 32561037) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS ), Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 pg / ml) (Invitrogen, Kat. Nr. 15140122) und 600 pg / ml Hygromycin B (CellGro, Kat. Nr. 30 bis 240-CR).
   * Die Effizienz der viralen Erholung höher ist in 6-cm-Schalen als in 35-mm-Gerichte. BHK/T7-9 Zellen mit niedrigen Gang-Level-Support höhere Erholung. Alternativ können auch andere BHK-Zelllinien, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase konnte ^4,5,16,17 verwendet ^werden.
2. Wenn die Zellen haben 70-80% Konfluenz erreicht, ersetzen Sie den Kulturüberstand mit frischem MEM-alpha mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (nicht mit Hygromycin B).
   
   * Die Zellen sollten transfected innerhalb von 1 Stunde nach dem Austausch des Mediums, den Verlust der T7-RNA-Polymerase Ausdruck zu vermeiden.
3. Für die Erholung der RVFV, eine Reihe von Plasmiden viralen genomischen RNAs für full-length virale RNA-Expression, und ein zweiter Satz kodiert virale Gen open reading frames für virale Protein-Expression (Abbildungen 1 und 2) sind erforderlich. Bereiten Sie eine Mischung der folgenden plasmids2 (Abbildung 2) in einem 1,5 ml-Tube:
   1. pProT7-S (+) mit Mutation (en) in der NSS-Gen (2 mg): Dieses Plasmid kodiert für die anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 S-Segment von der T7-Promotor flankiert und das Hepatitis Delta-Virus (HDV) Ribozymsequenz.
   2. pProT7-M (+) (2 mg): Dieses Plasmid kodiert für die anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 M-Segment durch die T7-Promotor und das HDV-Ribozym-Sequenz flankiert.
   3. pProT7-L (+) (2 mg): Dieses Plasmid kodiert anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 L-Segment flanked von der T7-Promotor und das HDV-Ribozym-Sequenz.
   4. pT7-IRES-VN (2 mg): Dieses Plasmid kodiert die RVFV MP-12 N open reading frame (ORF) hinter dem T7-Promotor und eine Encephalomyocarditisvirus (EMCV) interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES).
   5. pT7-IRES-vL (1 mg): Dieses Plasmid kodiert die RVFV MP-12 L ORF stromabwärts des T7-Promotors und eines EMCV IRES.
   6. pCAGGS-VG (1 mg): Dieses Plasmid kodiert RVFV MP-12 M ORF hinter dem Huhn beta-Aktin-Promotor.
      * Der Zusatz von pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL und pCAGGS-VG ist nicht notwendig für die Verwertung von MP-12, aber es steigert die Effizienz der ^Rettungs-2. Autoren erfahrene armen Ausdruck Gn / Gc mit pT7-IRES-Plasmid, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an undichten Scannen von AUGs von Ribosomen. Deshalb distanzieren wir uns pCAGGS-VG für cap-abhängigen Gn / Gc Ausdruck konstruiert.
      
      
4. 30 ml Transit-LT1 (Mirus, Kat. Nr. MIR2300) auf 385 ml Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) in einem 1,5 ml-Tube, und kurz vortexen.
5. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur langsam das Opti-MEM mit Liposomen, die Plasmid-Mischung aus Schritt 1,3 bis sanft durch Pipettieren gründlich mischen und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
6. Fügen Sie die Mischung von Liposomen und Plasmide in das Kulturmedium der BHK/T7-9 Zellen aus Schritt 1.2 Tropfen für Tropfen (Abbildung 3).
7. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO ₂ für 24 h, und ersetzen Sie den Kulturüberstand mit frischem MEM-alpha mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (nicht mit Hygromycin B).
8. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO ₂ für 4 weitere Tage (Inkubation für 5 Tage insgesamt), und sammeln die Kulturüberstände in eine 15 ml Tube.
   
   * Die zytopathischen Effekts (CPE) beobachtet hier nicht unbedingt das Ergebnis einer erfolgreichen viralen Erholung, da die TransfektionZelltod, die ähnlich CPE durch virale RNA-Replikation oder virale Proteinsynthese verursacht wird.
9. Centrifuge die Überstände bei 2.200 xg bei 4 ° C für 5 min.
   
   * Der Zweck dieses Schrittes ist es, Pellet nach der Zelltrümmer von viralen Lager. Ein aerosoldicht Zentrifugenbecher für erhöhte Sicherheit empfohlen.
10. Die Überstände in Schraubverschluss 5 ml Kryoröhrchen, und speichern Sie die Passage 0 (P0)-Virus Lager bei -80 ° C zur weiteren Verwendung.

2. Verstärkung von P0-Virus

1. Die P0 Proben enthalten oft unzureichend Virustiter für nachgeschaltete Experimente ^2. Eine Verstärkung Schritt in VeroE6 Zellen, die ein Klon des Affennierenfibroblasten (Vero-Zellen) fehlen die IFN-alpha/beta Gene ^18,19 wird, erhöht sich virale Titer bis zum Maximum. Alternativ fehlt anderen Zellen Typ-I-IFN Reaktionen wie Hec1B Zellen ²⁰ oder MEF-Zellen aus IFNAR1-Knockout-Mäusen ²¹ might für diesen Schritt verwendet werden. Verbreiten Sie VeroE6 Zellen in 10-cm-Schalen in modifizierter Minimum Dulbeccos essential medium (DMEM) (Invitrogen, Kat. Nr. 11965092) mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), und inkubieren bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO _2, bis sie 80% Konfluenz erreichen.
   * Recombinant MP-12-Stämme-Kodierung mutierten NSs oft nicht effizient replizieren in Typ-I-IFN-kompetenten Zellen.
2. 300 ml P0 Proben mit 2,7 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin. Entfernen Kulturmedium aus dem VeroE6 Zellen aus Schritt 2.1 und ersetzen mit dem verdünnten P0 Probe. Bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO _2.
3. Entfernen Sie die Inokula und 10 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin zu jedem Gericht.
4. Bei 37 ° C für 3 bis 4 Tage bis CPE von VeroE6 Zellen sichtbar wird.
   * Störung der Monoschicht erfolgt während MP-12-Infektion, while rekombinanten MP-12 fehlt NSS, wie rMP12-C13type (C13type) (Abbildung 4), keine Störung der Monoschicht, aber eine Reihe von toten schwimmenden Zellen erscheinen 2 bis 3 Tage nach der Infektion.
5. Ernte der Überstand bei 3 bis 4 dpi, wie in den Abschnitten 1,9) und 1,10 beschrieben), und bezeichnen die Proben als E6P1.

3. Titration von rekombinanten MP-12 von Plaque-Assay

1. Verbreiten Sie VeroE6 Zellen in 6-well Platten.
   * Doppelte Analyse pro Probe ist zuverlässiger als einzige Analyse.
2. Wenn VeroE6 Zellen haben zu 80% Konfluenz gewachsen, bereiten 10-fache serielle Verdünnungen von Virus-Proben in DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin bis zu 10-6 wie folgt:
   
   • 10 ul E6P1 Probe + 990 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 ^-2 Verdünnung)
   • 100 ul von 10 ^-2 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 ^-3 Verdünnung)
   • 100ul von 10 ^-3 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 ^-4 Verdünnung)
   • 100 ul von 10 ^-4 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10-5 Verdünnung)
3. Absaugen Medium aus dem 6-Well-Platte aus Schritt 3.1 und fügen 400 ul jeder Verdünnung (aus Schritt 3.2) in die Vertiefungen (Abbildung 3).
4. Bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO _2.
5. Während der Inkubation, bereiten zwei 15-ml-Röhrchen für die Agar-Overlay wie folgt:
   Rohr A (halten in 42 ° C Wasserbad): 7 ml von 1,2% edlen Agar (VWR, Kat. Nr. 101170-362) in Wasser
   U-Bahn B (keep in 37 ° C Wasserbad): 7 ml Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Kat. Nr. 11935046) mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml) und 10% Tryptosephosphat Brühe (MP Biomedicals, Kat. Nr. 1682149).
6. Nach 1 h Inkubation, entfernen Sie den VirusInokula, und sofort 2 ml pro Vertiefung einer 1:1-Mischung von Rohr A und Rohr B (aus Schritt 3.5).
   * Achten Sie darauf, um die Überlagerung sofort hinzufügen, wie Austrocknung von Brunnen verursacht den Tod der infizierten Zellen.
7. Die Inkubation bei 37 ° C für 3 Tage in einem Inkubator mit 5% CO _2.
8. Bereiten Rohr A und Rohr B wieder wie in Schritt 3.5 beschrieben. Bereiten Sie auch 500 ul von 0,33% Neutralrot-Lösung (Sigma Aldrich, Kat. Nr. N2889-100ml) pro Platte, die auch bei 37 ° C warmes Wasserbad gehalten wird.
9. Mix Rohr A, Rohr B und 500 ml (Endkonzentration. 0,011%) der Neutralrot-Lösung und 2 ml der Mischung pro Vertiefung.
   * Die Höhe der Neutralrot-Lösung hinzugefügt werden hängt von der Menge Neutralrot-Lösung und erste Optimierung erforderlich ist. Langzeitlagerung von 0,33% Neutralrot-Lösung zum Niederschlag. In solchen Fällen kann sich der Niederschlag vollständig durch Inkubation bei 55 ° C gelöst für 10 min durch kräftiges Schütteln folgte. Die Verwendung von gefälltem neutral red-Lösung führt zu schwache Färbung der Zellen, während wieder aufgelöst neutral rote Lösung färbt Zellen gut.
10. Die Platte für 16 h (oder über Nacht) bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO _2.
11. Zählen Sie die Anzahl der Plaques in den Brunnen, der von 10 bis 100 Plaques pro Well enthält. Berechnen Sie die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten / ml. Zum Beispiel, wenn wir beobachten 28 Plaques in den Gefäßen mit den 10 ^-5 Verdünnungen, 28 (Anzahl der Plaques) x (1 ml/0.4 ml) x 10 ⁵ (Verdünnung) = 7,0 x 10 ⁶ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) geimpft / ml (Abb. 5).

4. Screening von NSS-Mutanten fehlt der Typ-I-IFN Unterdrückung Funktion

1. Verbreiten Sie C57/WT MEF-Zellen (InvivoGen, Kat. Nr. MEF-c57wt), die einen abgesondert embryonalen alkalische Phosphatase (SEAP)-Gen induzierbar durch NF-kB und IRF-7.3 (Abbildung 6) codieren, in 12-Well-Platten. Die Zellen werden in DMEM mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penici gepflegtllin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), und Zeocin (100 pg / ml).
2. Wenn Zellen subkonfluenten (80%) werden, sind die Zellen mock-infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rekombinante MP-12-Codierung NSs Mutationen an Multiplizität der Infektion (moi) von 3 oder 0,1 (siehe Abschnitte 2 und 3, die Höhe der jeder Inokulum sollte 300 pl werden). Bei 1 h nach der Infektion, entfernen Sie die Inokula, und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung DMEM mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml) (Blasticidin und Zeocin sind derzeit nicht gegeben Zeit).
3. Mit 14 h nach Infektion, sammeln Kulturüberständen. Add 200 ul Quanti-Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) und 50 ul jeder Probe (in dreifacher Ausfertigung) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Seal und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 h.
   * Beide MP-12 und rekombinante MP-12 fehlt NSs deutlich induzieren Host translationale Suppression in IFN-alpha/beta kompetente Zellen, einschließlich 293-Zellen, MRC-5-Zellen und Maus EMBRYonic Fibroblasten (MEF)-Zellen nach 14 Stunden nach der Infektion bei hohen moi. Auf der anderen Seite sammelt sich IFN-beta-mRNA oder mRNA ISG56 reichlich bei 7 bis 8 Stunden nach der Infektion in Typ-I-IFN kompetenten Zellen. So wählten wir 14 Stunden nach der Infektion auf die Überstände zu sammeln, um die Ansammlung von SEAP durch angeborene Immunantwort induziert sehen.
4. Lesen Sie die OD-Werte bei 650 nm mit einem Platten-Lesegerät (Abbildung 7).
   * Die Ergebnisse sind konsistent mit den Daten von Northern Blot unter Verwendung einer RNA-Sonde spezifisch für Maus ISG56 mRNA, die up-Regulierung zeigt der ISG56 mRNA in Abwesenheit von NSS Ausdruck (Abbildung 8).
   * Es wird darauf hingewiesen, dass die SEAP-Aktivität durch die Fülle von Proteinen, die von Host-Übersetzung Tätigkeit betroffen sein könnten, bestimmt werden. Eine relative Niveau der SEAP möglicherweise nicht hoch im Vergleich zu dem Anstieg der mRNA, weil SEAP kann nicht einmal in der Gegenwart von SEAP mRNA synthetisiert werden, wenn zelluläre Übersetzung HGAEssed. Northern Blot ist ein einfacher Test und ein genauerer Weg, um die Menge der mRNA durch das Fehlen von NSS-Funktionen in infizierten Zellen als die SEAP Reporter-Assay induzierte bewerten. Allerdings ist die SEAP Reporter-System schneller als Northern-Blot-und damit nützlich für das schnelle Screening von NSS-Mutanten möglicherweise fehlt Host Transkription Unterdrückung funktionieren.
   
   

5. Repräsentative Ergebnisse:

Die reverse Genetik-System konsequent tragfähige rekombinanten MP-12-Viren mit Titern größer als 1 x 10 ⁶ pfu / ml erzeugt. C13type Virus fehlt NSs Funktionen gebildet große trübe Plaques, während MP-12 bildeten klare Plaques in verschiedenen Größen ² (Abbildung 5). Mock-infizierte C57/WT MEF Zellen oder solche mit MP-12 infiziert nicht zu einer Erhöhung der Ebene der SEAP in Kulturüberstand im Vergleich zu mock-infizierten Zellen, während die Kulturüberstand C57/WT MEF-Zellen mit C13type infiziert enthielt eine erhöhteNiveau der SEAP von 14 Stunden nach der Infektion (hpi) (Abbildung 7). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Northern Blot unter Verwendung einer RNA-Sonde spezifisch für Maus ISG56 mRNA (Abbildung 8).

Abbildung 1. Genome Struktur RVFV
RVFV hat einen dreiseitigen negativen Sinn oder AmbiSense RNA-Genom mit dem Namen S-, M-und L-Segment. S-Segment kodiert N-und NSS-Gene in einem AmbiSense Weise. N-mRNA wird von viralen-sense (negative-sense) S-Segment synthetisiert, während NSs mRNA von anti-viralen-sense (positive-sense) S-Segment synthetisiert wird. M-Segment kodiert für ein einzelnes M mRNA ab und synthetisiert the78kD, NSM, Gn-oder GC-Proteine, die durch undichte Scannen von mehreren AUGs bei 5'region von M-mRNA, die durch ihre Co-translationale Abspaltung ^22,23 folgten. L-Segment kodiert für die L-Proteins. Beide N und L-Proteine ​​sind wichtig für die virale Transkription und Replikation, während Gn und Gc der viralen Hüllproteine ​​sind. NSS und NSm Proteine ​​sind strukturelle Proteine, die nicht in Viruspartikeln eingebaut werden.

Abbildung 2.. Design von Plasmid-DNA für die Gewinnung von rekombinanten RVFV MP-12-Stamm
Die cDNA in voller Länge anti-viral-sense S-, M-oder L-Segment sind cloneddownstream der T7-Promotor und vor Hepatitis Delta-Virus (HDV) Ribozymsequenzen, wie pProT7-S (+) gekennzeichnet, pProT7-M (+) oder pProT7-L (+) bzw. ^2. T7-RNA-Polymerase in BHK/T7-9 Zellen exprimiert transkribiert die RNA-Kodierung in voller Länge S-, M-oder L-Segment mit präziser Genom 3'-Ende. Der offene Leserahmen (ORF) von N oder L-Proteine ​​sind unter Encephalomyocarditisvirus (EMCV) interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), die als pT7-IRES-VN oder pT7-IRES-vL bzw. gekennzeichnet sind, kloniert, um die uncapped ermöglichen T7-RNA-Transkript von Ribosomen in cap-unabhängige erkannt werdendent Weise. Die M ORF ist unter Hühnern b-Aktin-Promotor des pCAGGS Plasmid ^24, die als pCAGGS-VG bezeichnet wird geklont, um die Synthese von 78kD, NSM, Gn und Gc-Proteine, die aus verschiedenen AUGs durch undichte Scannen ²³ sind erzeugten ermöglichen. Beide N und L-Proteine ​​sind für die Initiation der Transkription oder RNA-Replikation benötigt, während die pT7-IRES-vN und pT7-IRES-vL nicht für die Gewinnung von rekombinanten MP-12 ² wesentliche, wahrscheinlich wegen der mutmaßlichen undichten Ausdruck Pol- II-driven capped RNA Transkripte N-ORF und L-ORF aus pProT7-S (+) und pProT7-L (+) bzw..

Abbildung 3. Rückgewinnung von RVFV MP-12 von Plasmid-DNA
Transfektion von Zellen mit BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL und pCAGGS-VG Plasmide (Abb.1 ) erzeugt rekombinanter RVFV MP-12-Stamm in Kulturüberstands. Der Überstand an 5 Tage nach der Transfektion gesammelt und passagiert an die frische Vero E6-Zellen für die virale Verstärkung. In der Regel können mehr als 1 x 10 ⁶ pfu / ml des Virus in 3 bis 4 Tage nach der Infektion wiederhergestellt werden. Die verstärkten Virus (E6P1 Virus) wird durch die Verwendung Plaque-Assay mit Vero E6-Zellen titriert und für Phänotyp-Analyse und Immunogenität Studien.

Abbildung 4. S-Segment der MP-12 und rMP12-C13type
Der Vergleich von MP-12 und rMP12-C13type (C13type) S-Segmenten. Im Vergleich zu NSs der MP-12-Stamm ist der NSS ORF C13type um 69% gekürzt, und ist identisch mit dem von Natur aus isolierten Klon 13 Dehnung ^2,25.

Abbildung 5. Plaque-Assay für MP-12 (funktionale NSS) und C13type (nicht-funktionale NSS)
Die Monoschicht von Vero E6 Zellen in einer 6-Well-Platte ist für Plaque-Assay verwendet. Nach 3 Tagen Inkubation mit 0,6% Agar-Overlay, das zweite Agar-Overlay mit Neutralrot-Lösung versetzt. Dann werden Plaques am Tag 4 nach der Infektion gezählt. MP-12 bildet klare Plaques unterschiedlicher Größen, während C13type bildet große trübe Plaques (oder Brennpunkte). Die gut mit 10 bis 100 Plaques sollte zum Zählen verwendet werden.

Abbildung 6. Activation Weg der sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) Reportergen in C57/WT MEF-Zellen
Interferon-beta Promotor umfasst die bindenden Sequenzen von AP-1, NF-kB und IRF-3. RVFV Replikation aktiviert AP-1, NF-kB und IRF-3 ^7,11. Allerdings hemmen NSs die Freisetzung von Repressor-Komplex aus der IFN-beta Promotors auch nach der Bindung von denen Transkriptionsfaktoren, damit die Unterdrückung der Synthese von IFN-beta mRNA ^26. Darüber hinaus NSs sequesters TFIIH p44 subunits8 und einelso fördert Abbau von p62 TFIIH Untereinheiten ^27, induzieren somit eine allgemeine Host-Transkription Unterdrückung einschließlich IFN-alpha-Gen und Gene unter die ISRE Promotor. C13type oder andere NSs Mutanten IFN-beta Unterdrückung Funktion induzieren IFN-beta-Synthese, die wiederum aktiviert die IFN-alpha-Promotor und der Interferon-sensitive Response-Element (ISRE) Promotor. IRF-7 wird dann transkriptionell hochreguliert durch IFN-alpha/beta Stimulation und weitere hochreguliert von IFN-alpha zur Unterstützung von IRF-3 ^28,29. In diesem Test kodieren C57/WT MEF-Zellen sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) am stromabwärts eines künstlichen Bindesequenz von NF-kB, IRF-3 und IRF-7. So regulieren die NSS-Mutanten fehlt IFN-beta Unterdrückung Funktion SEAP, deren Sekret wird dann gemessen.

Abbildung 7. Induktion von SEAP durch C13type
C57/WT MEF-Zellen (InvivoGen) wurden mock-Infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rMP12-C13type (C13type) bei moi von 3 (links) oder 0,01 (rechtes Bild). Kulturüberstände (50 ul) bei 14 hpi wurden mit 200 ul Quanti-Blue (InvivoGen)-Substrat in 96-Well-Platte und die OD-Werte bei 650 nm gemischt wurden nach 1 h Inkubation bei 37 ° C durch eine Platte Reader gemessen. Die relative Zunahme der SEAP zu Mock-infizierten Zellen gezeigt werden. Die Daten stellen den Mittelwert + / - Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Der Kulturüberstand von C13type-infizierten Zellen zeigt erhöhte SEAP deutet auf das Fehlen von Host-Transkription Unterdrückung von NSS.

Abbildung 8. Northern Blot mit DIG-markierten RNA-Sonde
Wild-Typ embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)-Zellen wurden mock-infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rMP12-C13type (C13type) bei moi von 3. Gesamt-RNA wurde bei 7 hpi mit Trizol (Invitrogen) und Northern b gesammeltviel wurde mit Digoxigenin-markierten RNA-Sonde spezifisch für Maus endogenen ISG56 mRNA oder MP-12 N mRNA / anti-viral-sense S-Segment ^2,30 durchgeführt. Zur Herstellung der Sonden für die Maus endogenen ISG56 mRNA oder RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-Segment, die PCR-Fragmente durch die Primers von KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) und HindmISG56 gesetzt (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) für ISG56 mRNA oder KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA TCA CTA AGA GCT TGC G) und HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) für RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-Segment wurden mit Kpn verdaut I und Hind III und ligiert pSPT18 Plasmid (Roche. Dann RNA-Sonden mit Digoxigenin wurden mit DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche synthetisiert, Cat # 1 175 025). Die 28S rRNA-Ebene der einzelnen Proben wird auch als Ladekontrolle gezeigt. Wildtyp-MEF-Zellen mit C13type induzierte ISG56 mRNA-Synthese infiziert, während diejenigen mit MP infiziert-12 Führte nicht zu er deutet auf das Fehlen von Host-Transkription Unterdrückung in C13type-infizierten Zellen. Die Daten stehen im Einklang mit den von SEAP-Assay in Abbildung 6 erhalten.

Diskussion

Die reverse Genetik für RVFV wurden von mehreren Gruppen wurden durch den Einsatz T7-Promotor ^2,4,5 oder Maus ³ oder menschliche ⁴ pol-I-Promotor entwickelt. In diesem Manuskript, beschreiben wir ein Protokoll zur rekombinanten RVFV MP-12-Stämme mit BHK/T7-9 Zellen ^15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase zu erzeugen. Die Effizienz der viralen Erholung variiert je nach Zustand des BHK/T7-9 Zellen, die Menge von Plasmiden, die Anzahl der transfizierten Zellen und so weit...

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha	Invitrogen	32561037
Dulbecco modifiziertem Minimum Essential Medium	Invitrogen	11965092
Modified Eagle Medium (MEM 2x)	Invitrogen	11935046
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Hygromycin B	CellGro	30 bis 240-CR
Tryptosephosphat Brühe	MP Biomedicals	1682149
Edle Agar	VWR	101170-362
Transit-LT1	Mirus	MIR2300
Opti-MEM	Invitrogen	31985070
Aerosol dichten Deckel	Eppendorf	C-2223 bis 25
0,33% Neutralrot-Lösung	Sigma Aldrich	N2889-100ML
C57/WT MEF-Zellen	InvivoGen	MEF-c57wt
Blasticidin S	InvivoGen	Ant-bl-1
Zeocin	InvivoGen	ant-Zn-1
Quanti-Blue	InvivoGen	rep-QB1
BHK/T7-9 Zellen 15	Gifu University, Japan
Vero E6-Zellen	ATCC	CRL-1586