Die Messung der γHV68 Infektion bei Mäusen

Zusammenfassung

γ-Herpesviren (γ-HVS) zu etablieren lebenslange Persistenz in ihrem Gastland. Die Infektion von Mäusen mit γ-HV68 bietet einen genetisch manipulierbaren In vivo Modell für die Charakterisierung des Lebenszyklus / Pathogenese der γHVs. Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis und die Quantifizierung von γHV68 Infektion bei akuten und latenten Stadium nach der Infektion durch Plaque-bildenden, Infektions-Center und qPCR-Assays.

Zusammenfassung

γ-Herpesviren (γ-HVS) zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, latente Infektionen des lymphatischen Zellen ¹ zu etablieren. Die engen Wirtsspektrum der menschlichen γ-HVS, wie EBV und KSHV hat stark detaillierte pathogene Studien erschwert. Murine γ-Herpesvirus 68 (γHV68) Aktien umfangreichen genetischen und biologischen Ähnlichkeiten mit menschlichen γ-HVS und ist eine natürliche Erreger der murid Nager ^2. Als solche Auswertung γHV68 Infektion von Mäusen Inzuchtstämme in verschiedenen Stadien der Virusinfektion stellt ein wichtiges Modell für das Verständnis viralen Lebenszyklus und Pathogenese während γ-HVS-Infektion.

Nach intranasaler Inokulation γHV68 Infektion führt zu einer akuten Virämie in der Lunge, die später in eine latente Infektion von Splenozyten und anderen Zellen, die während der gesamten Lebensdauer des Wirtes ^3,4 reaktiviert behoben werden können. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie die Plaque-Assay zu beurteilen verwendens infektiösen Virustiter in der Lunge Homogenaten auf Vero-Zell-Monolayer in einem frühen Stadium (5 bis 7 Tage) von post-intranasale Infektion (dpi). Während einer akuten Infektion ist weitgehend geklärt 2 - 3 Wochen nach der Infektion, eine latente Infektion der γHV68 ist rund 14 dpi erstellt und fortgeschrieben später in der Milz der Mäuse. Latente Infektion in der Regel wirkt sich auf eine sehr kleine Population von Zellen in den infizierten Geweben, wobei das Virus bleibt ruhend und schaltet den größten Teil seiner Genexpression. Latent infizierte Splenozyten spontan reaktivieren Virus auf Explantation in Gewebekulturen, die durch einen infektiösen Center (IC)-Assay rekapituliert werden kann, um das virale latente Belastung zu bestimmen. Zur weiteren Abschätzung der Menge des viralen Genoms Kopien in der akut-und / oder latent infizierten Geweben, quantitative real-time PCR (qPCR) ist bekannt für seine maximale Empfindlichkeit und Genauigkeit verwendet. Die kombinierte Analyse der Ergebnisse der qPCR und Plaque-Assay, und / oder IC-Assay wird zeigen, der raum-zeitlichen Profile der viralenReplikation und Infektiosität in vivo.

Protokoll

Das folgende Protokoll beschreibt die Studie der Virustiter und viralen Genoms Lasten in den lytischen und latenten Infektion Zyklus γHV68 in Mäusen, die theoretisch benutzt werden, um Infektionen durch andere Viren, die ähnliche Lebensweise, dass der γHV68 bewerten.

1. Verstärkung von γHV68

1. Tauwetter eine gefrorene Flasche γHV68 in 37 ° C Wasserbad.
2. Add viralen Inokulums zu NIH3T12 oder 3T3 Zellkultur (~ 50% Konfluenz) in 10 cm Schalen und Kultur der infizierten Zellen bei 37 ° C in 5% CO _2.
3. Untersuchen Sie die Kultur von Mikroskopie für zytopathischen Effekts (CPE) und sammeln die Medien zu einem Zeitpunkt mehr als 80% der Zellen CPE 4 zeigen ~ 5 Tage nach der Infektion. Zur Maximierung der Ausbeute an Virus, kann die infizierte Zellkultur zweimal, um alle Zell-assoziierten γHV68 Release eingefroren und aufgetaut.
4. Centrifuge der gesammelten Medien bei 1000 rpm für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um Zelltrümmer zu entfernen.
5. Sorgfältig Transfer der Überstände, neue Rohre (High-Speed-Zentrifugenröhrchen), ohne die Zelltrümmer am Boden.
6. High-Speed-Zentrifuge bei 12.000 rpm (Sorvall SA für-600) bei 4 ° C für mindestens 1,5 Stunden zu konzentrieren Viruspartikel.
7. Entsorgen Sie die Überstände in 10γ Bleichlösung und sorgfältig resuspendieren des Pellets (Virus-und Rest-Zelltrümmer) mit 1 ml serumfreiem DMEM. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in ein 1,5 ml Mikro-Zentrifugenröhrchen und gut mischen durch Vortexen.
8. Säule für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit, um restliche Zelltrümmer zu entfernen und den Überstand (Virus Lager) in ein neues Röhrchen. Dies ist der letzte virale Lager für eine Infektion. Der Titer des Virus Lager wird durch Plaque-Assay (siehe unten) bestimmt.

2. Intranasale Infektion von Mäusen mit γHV68

1. Infect Mäuse bei ~ Alter von 6 Wochen mit 1.000 ~ 5.000 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) von γHV68 pro Mäusen.
2. AnästhesierenMäusen durch Injektion von Ketamin / Xylazin (60 ul / Maus aus einer Mischung von 80 mg / ml Ketamin und 12 mg / ml Xylazin) in Bauchhöhle. Monitor-Anästhesie durch Kneifen der Mäuse Zeh. Es dauert in der Regel ~ 5-10 min. Wenn Mäuse nicht vollständig betäubt, werden sie niesen das Virus.
3. Wenn die Maus voll narkotisiert ist, verwenden Sie eine Pipette auf ~ 30 ul PBS γHV68 (15 ul an jedem Nasenloch), um Mäuse zu impfen langsam, aber stetig Drop-by-drop. Seien Sie sicher, dass die Maus ist in der Tat das Einatmen der Tropfen ohne zu versuchen, Blasen zu bilden.
4. Lassen Sie die Maus für 10-15 min zu erholen und zu überwachen das Wohlbefinden der Mäuse (zB Bewusstsein, Atmung, etc.), bevor sie dann wieder in den Käfig. Die Tiere werden täglich für die Krankheit und die Angemessenheit von Nahrung, Wasser und Einstreu Bedingungen überprüft. Wenn klinische Zeichen einer Krankheit, Schmerzen oder Ängste zu entwickeln, wird der Routinediagnostik zur Ätiologie zu bestimmen durchgeführt werden. Tiere, die mehr als 20% ihres Körpergewichts verlieren, wird für maximale Gewichtsverlust aufgezeichnet werdenund eingeschläfert. Die endgültige Entscheidung zur Euthanasie führen, liegt im Ermessen der klinischen Tierarzt und wird nach Rücksprache mit dem Principal Investigator.

3. Plaque-Assay auf der Virustiter in akut infizierten Lunge fest

1. Virus Infektiositätstiter werden durch die Bildung von Plaque auf Monoschichten von Vero-Zellen bestimmt.
2. Vero-Zellen werden bei 2.5x10 ⁴ Zellen / well in 12-Well-Platten ausgesät am Tag vor Plaque-Assay. Die Zellen sollten gleichmäßig verteilt werden und die Zelldichte sollte 30 zu erreichen - 40% am Tag der Plaque-Assay.
3. Bereiten Sie 0,5% (w / v) Methylcellulose (MC)-Overlay-Medium (Tabelle 1).
4. Sacrifice γHV68-infizierten Mäusen 5-7 Tage nach intranasaler Infektion Akute-Phase-Virustiter in der Lunge zu bestimmen. Für euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) wird verwaltet IM durch intravenöse Überdosis Pentobarbital Na (30-50 mg / kg IP) verfolgt werden. Diese Methode wird von t zugelassenEr American Veterinary Medical Association.
5. Ernte der Lunge und spülen Sie zweimal mit 1 x PBS, um Blutzellen zu entfernen. Sammeln einseitig von den Lungen in 1 ml eiskaltem kompletten DMEM-Medium und halten auf dem Eis. Schnell frieren Sie die andere Seite der Lunge und bei -80 ° C für die Prüfung virale DNA Lasten in die Lunge, die durch qPCR (siehe unten).
6. Verwenden Sie ein Gewebe-Homogenisator zu Lungengewebe bei maximaler Geschwindigkeit homogenisieren für 1 sec, Frost-und Tauwetter-dreimal. Waschen Sie den Homogenisator mit 70% Ethanol bei jedem Schritt beim Wechsel der Probe.
7. Centrifuge das homogenisierte Gewebe bei 3.000 rpm für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und Übertragung auf neue Röhren für Plaque-Assay.
8. Bereiten Sie serielle Verdünnungen (in der Regel von 10 ° bis 10 ^-8) der Lunge Homogenat Proben in 1,5 ml Mikro-Zentrifugenröhrchen mit klarem DMEM durch Wirbel. Prefill die entsprechende Anzahl von Rohren mit 540 ul DMEM und verdünne 60 ul Homogenat in das erste Rohr. Transfer-60 ul vom ersten Rohr inicht die nächste, und so weiter.
9. Saugen Sie Medien aus dem vorbereiteten Vero Monoschichten in der 12-Well-Platten und laden 200 ul / well seriell verdünnt Homogenat mit infektiösen Viren in umgekehrter Reihenfolge (von 10 ^-8 bis 10 °). Verwenden Sie zwei Vertiefungen für jede Titration (in zweifacher Ausfertigung).
10. Inkubieren Vero-Zellen mit dem Virus Impfkulturen 1 Stunde bei 37 ° C. Vorsichtig schwenken die Platten alle 15 Minuten gleichmäßig zu verteilen, um das Virus über die Monoschicht.
11. Entfernen Sie die Impfkulturen und ersetzen Sie es mit 2 ml / well der Overlay-Medium (Tabelle 1). Die Platten für eine Woche bei 37 ° C.
12. Entfernen Sie Overlay-Medium (muss nicht vollständig sein), und ersetzen mit dem Update / Fleck Medium der Plaque-Assay (Tabelle 1) und Inkubation für mindestens 1 h bei RT.
13. Wenn die Platten werden getrocknet, zählen die Anzahl der gut isolierte Plaques bei jeder Verdünnung. Zur Minimierung der Fehler, werden nur die Brunnen, die zwischen 10 und 100 Plaques gezählt.
14. Berechnen Sie die Virustiter mit folFlügel Formel: Titer (pfu / ml) = [(Anzahl der Plaques / well) / (Volumen von Impfkulturen / well)] x Verdünnungsfaktor.

4. Infektiöse Zentrum Assay auf die Viruslast in latent infizierten Milzzellen Bestimmen

1. Viral latente Belastung durch infektiöse Center (IC)-Assay auf dem Monolayer von Vero-Zellen bestimmt. Am Tag vor IC-Assay, Saatgut Vero-Zellen in 6-Well-Platten (1 -. 2,5 x 10 ⁵ Zellen / well Wir verwenden normalerweise 11 Brunnen pro Milz Probe, 10 Brunnen werden für die seriell verdünnt Splenozyten Suspension eingesetzt werden und eine gut zum Testen spontanen Reaktivierung des Virus nach Frost-Tau-Zyklen.
2. Sacrifice den infizierten Mäusen nach Latenz etabliert ist (12 bis 14 Tage nach der Infektion). Ernten Sie die Maus-Milz-und Pool sie in 1 ml DMEM gekühlt.
3. Mechanische Dissoziation von Maus-Milz. Übertragen Sie die frisch isolierten Maus Milz in eine 10 cm Platte und mit 10 ml der gewünschten Medium wie DMEM mit 2% FBS. Wet Zwei matt-End-Glas MikroskopOPE Dias mit eiskaltem Medium. Legen Sie die Milz auf der mattierten Seite einer Rutsche und nick die Kapsel mit dem Rand der mattierten Ende des anderen gleiten. Mechanisch distanzieren der Milz zwischen zwei Folien, bis alle roten Klumpen zerkleinert werden (auch entfernen, Fett-Teilchen falls vorhanden).
4. Spülen Sie Folien mit DMEM, um die verbleibenden Zellen auf beiden Folien zu erholen.
5. Übertragen Sie die gesamte Gewebesuspension sanft durch eine Zelle Sieb (40 um Nylon-Mesh) in einen 50 ml konischen Röhrchen mit Schraubverschluss. Waschen Sie die 10 cm Schüssel mit dem Milz-Homogenate mit 10 ml PBS und Transfer während Filterung.
6. Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellsuspensionen 10 min bei 375 xg und Überstand verwerfen. Flick die Zellpellets zu brechen bestehende Zellklumpen. 5 ml ACK-Puffer (Tabelle 1), um die roten Blutzellen zu lysieren. Inkubieren 5 min und Zentrifuge wieder bei 375 x g.
7. Überstand verwerfen und wieder aussetzen Pellets, gründlich und schonend, in PBS mit 2% FBS. Keep Zellen bei 4 ° C. Mit einer PipetteSchmutz entfernen, falls vorhanden. Graf lebensfähigen Zellen mit Hilfe eines automatischen Zell-Zähler (Bio-Rad).
8. Spin auf der PBS-resuspendiert Splenozyten bei 375 xg für 4 min. Überstand verwerfen und die Zellen in 4 ml komplettem DMEM (2 x 1 ml wird für die IC-Assay der ursprünglichen Suspension eingesetzt werden, 0,6 ml für serielle fünffache Verdünnung in IC-Assay verwendet, 0,4 ml für die virale DNA-Präparation und qPCR, und 1 ml Suspension wird zur spontanen Reaktivierung des latenten Virus nach drei Gefrier-Auftau-Zyklen zu bewerten)
9. Bereiten Sie serielle fünffache Verdünnung (dh 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) von Splenozyten Suspension in Duplikaten. Prefill die 15 ml konischen Röhrchen mit 2,4 ml DMEM und verdünne 600 ul Splenozyten Suspension in das erste Rohr und gut mischen. Transfer-600 ul der letzten Röhre in die nächste Röhre, etc. Nicht Wirbel!
10. Saugen Sie das Medium aus den vorbereiteten 6-well Monolayer von Vero-Zellen. Seed 1 ml der seriell verdünnten Splenozyten auf Vero-Zellen mit jeder Verdünnung duplicated (10 Bohrungen werden für 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 Verdünnung verwendet werden).
11. Die Platten 8-12 Uhr bei 37 ° C und 5% CO _2. Nicht mehr als 24 Stunden. Saugen Sie die gesetzten Splenozyten Federung und Last 4 ml Overlay-Medium (Tabelle 1) in jede Vertiefung. Inkubieren für weitere 6 Tage.
12. Bestimmen Sie die Höhe der Milz infektiösen Zentren durch die Färbung der Platten mit 0,2% (w / v) Kristallviolett als in Plaque-Assay gezeigt.

5. Die Quantifizierung des viralen Genoms

1. Auszug gesamten genomischen DNA aus dem γHV68-infizierten Geweben, wie Lunge und Milz Proben in diesem Experiment. Verwenden Sie die DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) nach dem Protokoll des Herstellers.
2. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration jeder Probe die gleiche Menge an DNA, die für die qPCR-Assay verwendet sicherzustellen. Entwerfen Sie das virus-spezifischen Primer (~ 200 bp Amplikon ist für eine qPCR-Assay bevorzugt). Wir nutzten die γHV68 ORF56-spezifische Primer (forward-Primer: 5 & prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; Reverse-Primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') für diesen Assay und β-Aktin-Primer (forward-Primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'Reverse-Primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') als eine Steuerung für die qPCR-Reaktion.
3. Mischen Sie die DNA-Probe (100 bis 500 ng ist gut) und geeigneten Primer mit 2 x SYBR Master Mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Verwenden Sie die Bio-Rad Real-Time PCR-System, um die Viruslast in den infizierten Geweben zu quantifizieren. Führen Sie die PCR unter folgender Bedingung: 95 ° C für 15 min und 45 Zyklen bei 95 ° C für 30 min, 60 ° C für 30 min und 72 ° C für 30 min, von Schmelzkurve analysiert gefolgt, sowohl für die virale und Aktin-Amplikons.
4. Um eine Standardkurve für die Quantifizierung der viralen Genomen zu machen, seriell verdünnt bekannten Mengen eines γHV68 Bacmid DNA mit der genomischen DNA aus nicht infizierten Zellen isoliert. Run qPCR parallel mit der DNAs Von der InfektionTed Gewebe mit dem gleichen Satz von Virus-spezifischen Primer.
5. Gegenwart des viralen Genoms Belastung in den Geweben, wie virale DNA Kopienzahl pro Einheit (zB 100 ng oder 500 ng) genomischer DNA nach Aktin-Normalisierung.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 zeigt die allgemeine Systematik der Experimente zur Messung der γHV68 Infektion in Mäusen in vivo. Repräsentative Ergebnisse der Virustiter in der Lunge während der akuten Infektion der γHV68, wie durch Plaque-Assay bestimmt wurden in Abbildung 2a dargestellt. Eine Mutante von γHV68 mit nicht-funktionale virale Bcl-2 (vBcl-2) auf einem Niveau vergleichbar mit Wildtyp-γHV68 in der Lunge nach 7 Tagen intranasale Infektion von BALB / c-Mäuse (6 bis 7 Mäuse pro Gruppe) repliziert. Keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Lunge Titer des Virus wurden zwischen beiden Gruppen festgestellt. Diese Daten zeigen, dass vBcl-2 ist kein entscheidender Faktor für die akute Infektion γHV68 inMäusen. Doch durch 28 Tage nach Infektion, sank der Titer vBcl-2-Mutante Virus in der Milz 6 - bis 10 - fache im Vergleich zu den WT, als durch infektiöse Zentrum Assay (Abbildung 2B) gemessen, was darauf hindeutet, dass die vBcl-2-Mutante γHV68 Virus ist bei der Aufrechterhaltung der Milz Latenzzeit nach der Infektion defekt. In Absprache mit den reduzierten infektiösen Zentrum Titer wurde das virale Genom Belastung der vBcl-2-Mutante Virus schwer im Vergleich zu der WT-Viren am Tag 28 in wiederholten Experimenten, wie in Abbildung 2C dargestellt reduziert. Der enge Zusammenhang zwischen viralen Genoms Lasten und der Häufigkeit der latent-HV68vBcl-2-Mutante Virusreaktivierung ex vivo bei latenten Stadium der Infektion Highlights einer Latenzzeit Defekt dieser Mutante Virus-Infektion.

Abbildung 1. Schematische Darstellung zur Messung von γHV68 Infektion in Mäusen durch die Bildung von Plaque, Infektions-Center und qPCR-Assays.

Abbildung 2. Lytic und latente Infektion der WT-und Mutanten-γHV68 Viren in vivo. Akute Replikation (A) des WT-und Mutanten-vBcl-2 γHV68 Viren in den Lungen der BALB / c-Mäusen bei 7 dpi (Tag nach der Infektion) wurde durch Plaque-Assay bestimmt. (B und C) Milz infektiösen Zentren (B) und viralen Genoms Last (C) in der Milz infizierter Mäuse wurden bei 28 dpi durch infektiöse Zentrum Assay und qPCR gemessen. Rote Linien, die Mittelwerte der angegebenen Werte. ns, nicht signifikant.

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Diskussion

γHV68 wurde weithin als Modell benutzt, um die Pathogenese der menschlichen γ-HVs ^2,4,5 verstehen. In diesem Protokoll beschrieben wir drei routinemäßig eingesetzten Methoden, einschließlich Plaque-Assay für infektiöse Virustiter, IC-Assay für die virale latente Belastung und qPCR für virale Genom zu laden, um die akute und latente Infektion der γHV68 nach intranasaler Impfung bei Mäusen zu bewerten.

Die Plaque-Assay wurde intensiv an der Virustiter in den infizierten Z...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Herstellvorschrift
Methylcellulose (MC)-Overlay-Medium für die virale Plaque-Assay	Hitze ~ 250 ml destilliertem Wasser in TC-Flasche auf> 80 ° C (Kochen für 3 min in der Mikrowelle) Add allmählich 2,5 g MC-Pulver in das heiße Wasser, unter Rühren bei schwacher Hitze, bis sie gelöst. Autoclave sofort für 15 min bei flüssigen Zyklus. Das Rühren der autoklaviert MC Media bei 4 ° C über Nacht. Kombinieren Sie 250 ml MC Medien mit 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS auf 500 ml Overlay-Medien zu geben.
Fix / Fleck Medium für Plaque-Assay	0,2% (w / v) Kristallviolett in 20% Ethanol.
ACK-Lysepuffer	NH 4 Cl 0,15, KHCO 3 10 mM, EDTA 0,1 mM
Komplette DMEM	Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco-BRL); (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS Invitrogen) ergänzt.

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753
Xylazin	Sigma-Aldrich	X1251
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512-250g
2 x MEM	Life Technologies	11935
Zellsieb	BD Faclon	352340
Omni Gewebe-Homogenisator	Omni International	TH115
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
IQTM SYBRH Green Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 real-time PCR-System	Bio-Rad	184-5072
Zellzähler	Bio-Rad	145-0001
Sorvall SA-600	Thermo Scientific	096-124022